题记：近日，Nature 杂志的一篇封面文章报道了隐花色素蛋白中自由基对光化学反应的磁敏特性，第一次从实验上检验了候鸟的量子罗盘假说，引起学术界乃至全社会的广泛关注和热烈讨论。在文章发表后的3周时间内，全球累计有7种语言的新闻报道，其中BBC新闻频道在晚间黄金时段详细介绍了这项研究，Twitter上约有570万点赞转发，Youtube上相关视频的约有15.7万次观看。本文将系统性地介绍这项科学研究的前因后果。

从河洲上亭亭玉立的“关关雎鸠”，到泰戈尔窗棂边啁啾的“夏日飞鸟”，人类对鸟儿的喜爱之情源远流长，并注意到有些特定的鸟只在特定季节出现。亚里士多德曾假定冬季里消失的那些鸟是沉在湖底冬眠了。罗马皇帝腓特烈二世指出，冬眠是不可能的，那些鸟类是迁徙到另一个温暖富饶的地方去了。1855年，前苏联动物学家米登多夫提出候鸟可能利用地磁场进行长途导航。随着实验科学的发展，越来越多的科学家证实候鸟（如欧洲知更鸟）利用地磁场信息进行定向导航，而且是依赖于地磁场的倾角。

地磁场的强度很弱，大约只有0.4-0.6高斯（40-60微特斯拉），比普通冰箱贴的磁力弱200倍。鸟儿该拥有一套何等精密灵敏的磁感应系统，才得以感知这微弱的磁场？1978年，德国化学家Klaus Schulten提出假说：自由基对机制可能介导鸟类磁感应，这个假设基于非经典物理学，属于量子生物学的范畴。2000年，Klaus Schulten和他的学生生物物理学家Thorsten Ritz等人通过理论计算，推测光敏蛋白隐花色素（cryptochrome, Cry）是一种可能的磁感应蛋白。

候鸟量子罗盘假说

简单来说，量子罗盘是指，外部磁场信息可以转化为隐花色素蛋白中的光致自由基对量子产率变化，从而被细胞感知。具体来说，自由基是指拥有未配对电子的分子和基团，当电子从甲分子转移到乙分子后，原本有偶数个配对电子的甲分子由于失去了一个电子，变成了自由基，同时乙得到了一个电子，其电子也未配对（图1A）。这两个未配对的电子自旋相干，相距一定距离，在多种微观作用力下产生量子纠缠现象。

首先是超精细作用（hyperfine interaction），即最外层未配对电子与原子核相互作用，由于未配对电子在原子核周围非均匀分布，因此超精细作用是各相异性的，如果将这种作用力其看成一个球，它不是一个正球体，而是橄榄球性，并且球体上不同部位的软硬程度不一样，这构成了自由基对机制介导磁场方向敏感性的基础：不同方向的磁场对自由基系统产生的影响不同。

其次是塞曼效应（Zeeman interaction），即未配对电子与外界磁场的相互作用(图1B)，其结果是外界磁场可以影响自由基对自旋状态的能量分级，这也是当前这篇Nature文章研究的着力点。自由基的自旋状态可以在单线态和三线态之间互换，这两种状态的自由基均能进一步形成稳态自由基，即“产物”，用于下一步的信号传导，而只有单线态自由基可以快速恢复为基态物质，即“反应物”。当施加一定强度的人工磁场后，自由基对的三线态能级被劈开，一部分高于单线态能量，一部分低于单线态能量，无论哪部分都无法自由互换为单线态，其结果是“反应物”和“产物”量发生变化。

图1 知更鸟隐花色素蛋白内的电子传递形成自由基对（A），后者的自旋状态受到地磁场的影响（B）。

B图来源：

假说验证第一步：蛋白表达

隐花色素蛋白受蓝光激发后，电子可从色氨酸跳跃到该蛋白的内置辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD)，构成活跃的自由基对[FAD•-TrpH•+]，外加磁场的塞曼效应使得三线态能级分裂，由于能量差异的存在，单线态的自由基无法自由转变为三线态，而是恢复为基态物质，因此基态FAD和色氨酸量增多，产物FADH•和Trp•减少。很显然，人类无法用肉眼观测到电子的这些自旋状态改变，但是我们可以利用光谱测试区分基态（反应物）和自由基对（反应产物），这主要得益于自由基对产物和基态反应物光吸收谱不同（500-600nm和450nm）。

要想验证上述隐花色素蛋白的自由基对磁敏反应，最直接的方法是对该蛋白质样品进行磁场条件下光谱测试，而这类的生物物理学测试通常需要大量的高纯度隐花色素蛋白质样本。在过去，人们从几千克的动植物组织才能提取出痕量的目的蛋白，且很难分离纯化。随着生物技术的发展，科学家们通过体外培养细胞来生产目的蛋白，也即重组蛋白表达，其原理是将目的基因导入到宿主细胞中（如细菌、酵母或动物细胞），诱导目的基因的表达，并根据预设的人工标签进行分离纯化目的蛋白。在实际生产过程中，外源蛋白质的表达往往受到诸如错误折叠、低表达水平和低溶解度等困难的阻碍，而鸟类的隐花色素蛋白的表达和纯化一直是领域内的一个难题，在以往的尝试中，常常由于蛋白质结构的错误折叠导致隐花色素丧失FAD这一关键的辅因子，也就无法形成[FAD•- TrpH•+]自由基对，以致于自由基对磁感应假说（于1978年提出）迟迟未能被实验证实。约半个世纪后的今天，科学家们终于获得了结合FAD的候鸟如欧洲知更鸟的隐花色素蛋白。在Henrik Mouritsen教授和谢灿教授的指导下，该研究论文的第一作者许静静利用实验室定制优化后的Cold-Shock蛋白表达系统，率先表达并纯化了功能性的候鸟Cry4蛋白，该蛋白质样品因FAD发色团的存在而呈现出美丽透明的黄绿色，质谱分析显示该蛋白的FAD结合率高达97%，为接下来的生物物理学测试奠定了基础。

检测自由基对的形成与变化

光谱吸收测试结果显示，在连续14.45分钟的蓝光照射下，FAD总量递减，FADH•半醌自由基产量增加，这意味着发生了分子间的电子转移形成FAD•-，并且后者进一步被质子化形成了FADH•。此还原态的FADH能否快速被再氧化为FAD，从而为响应下一次光磁刺激作准备？先前有报道称，鸡和鸽子的Cry4蛋白需要十几个小时的时间才能从还原态FADH回到氧化态FAD，如此缓慢的再氧化态过程似乎很难为鸟类及时准备足够的FAD，作为感应下一个磁场刺激的物质基础，因此有一部分科学家质疑[FAD•- TrpH•+]自由基对机制。

事实上，前人的再氧化实验中使用了强还原性的溶液。本文的研究结果明确显示，在中性氧化还原的缓冲液中，光致还原的FADH在13-15分钟内再氧化为FAD，其反应速率远远地高于原来的预期。当然，由于目前我们对鸟类体内细胞液的氧化还原性知之甚少（尤其是隐花色素蛋白所在的视锥细胞），因此很难对于FAD的体内氧化还原反应速率作出结论。值得指出的是，候鸟在长途飞行中代谢旺盛，其有氧代谢的副产品活性氧物质，可能会为FADH的快速再氧化提供有利的条件。因此，研究人员推测在鸟类飞行过程中，这一反应速率可能会得到再次提速以满足磁导航的需求。

关于隐花色素蛋白磁场效应的检测

牛津大学的研究团队开发了一系列光谱学技术，专门用来研究隐花色素光化学磁场效应，包括瞬态吸收光谱测试（Transient absorption spectroscopies），共振腔环路衰减光谱测试（Cavity ring-down spectroscopy， 图2），宽带腔增强吸收光谱测试（Broadband cavity-enhanced absorption spectroscopy）以及电子顺磁共振（Electron paramagnetic resonance）。

简单来说，研究人员该蛋白样品放置于磁场中，并用450nm蓝光照射，检测不同磁场条件下以及不同时间分辨率下，该蛋白瞬态自由基对的光吸收变化。实验结果显示，施加磁场后，隐花色素蛋白中的自由基对产量发生了变化，即磁场效应（magnetic field effect），并且候鸟（欧洲知更鸟）的隐花色素蛋白比非候鸟（鸡和鸽子）的隐花色素蛋白磁场效应强10到20倍。

图2 共振腔环路衰减光谱仪的示意图，用于测量磁场条件下隐花色素蛋白中自由基的浓度

奥尔登堡大学的研究人员进一步制备了隐花色素的色氨酸突变体蛋白，即电子传递链上的4个色氨酸（分别为WA、WB、WC和WD）依次由苯丙氨酸（F）替代，后者无氧化还原活性，不能给FAD提供电子，可达到阻断电子传递链的效果。在各突变体蛋白中，电子传递链依次被截短为3个、2个和1个色氨酸，瞬态吸收光谱测试结果显示，突变体蛋白的自由基对寿命由微秒缩短为纳秒、皮秒级别。电子顺磁共振测试结果显示，野生型蛋白的自由基[FAD·+ TrpDH·+]相距2.2nm, 第4个色氨酸被突变以后，自由基对[FAD·+ TrpcH·+]相距1.8nm。该实验结果与理论模拟吻合，在野生型隐花色素蛋白中，电子依次在四个色氨酸间转移，这4步转移使得最终未配备电子相距最远，从而形成了长寿命的自由基对，后者自旋相干的超精细作用（Hyperfine Interaction）是磁场作用点。

意外发现：绝妙的复合自由基对

令人惊讶的是，当最远端第4个色氨酸被突变之后，蛋白质的磁场效应反而比野生型蛋白更强，并且比同是三色氨酸电子传递链的拟南芥植物隐花色素的磁场效应强。问题来了，为什么大自然要为鸟类隐花色素蛋白进化出第4个色氨酸，如果它的作用仅仅是降低磁场灵敏性。进一步研究显示，野生型蛋白（ErCry4）和突变体（ErCry4 WDF）在毫秒时间内的衰变动力学反应相似，并且磁场二分值（B1/2）相近，这意味着二者的磁敏性起源一致，均来自第3个色氨酸，第4个色氨酸可能并未参与动物磁感应过程。那么这第4个色氨酸介导的电子传递究竟发挥什么作用呢？

奥尔登堡大学的Ilia Solov’yov课题组与牛津大学的Peter Hore课题组通过量子计算和自旋动力模拟，并基于上述实验结果，提出了自由基对动态平衡机制：电子在第3和第4色氨酸之间可能来回跳跃，由此形成的两个自由基对[FAD·- TrpCH·+]和[FAD·+ TrpDH·+]处于一种快速动态平衡中（图3），并分别扮演不同的角色，由黄素-第三色氨酸形成的自由基对主要负责磁场感知，由黄素-第四色氨酸形成的自由基对主要负责体内生化信号传导，这一机制在以前任何物种的隐花色素蛋白中都未发现过。

图3 候鸟的复合自由基对机制原理图

科学家还预测，也许在体内还存在与隐花色素蛋白互作的其他蛋白，如曾经报道过的MagR或者其他尚未鉴定的信号分子，实现信号的级联放大或者对隐花色素蛋白的定向排列，进一步增强在生物体内的磁敏感性和对方向的识别，当然这些推测都需要未来更多的实验去证实。

总之，隐花色素蛋白在磁场中经历了一系列光化学反应，其电子在磁场中旋转跳跃，时而吸收蓝光，时而吸收黄绿光。或许大自然正是通过这种精巧机制，绝妙地优化了隐花色素蛋白的自由基光化学反应，随着电子的来回跳跃，隐花色素在磁场中闪烁着，就这样完成了磁场感受和信号传导的双重功能，从而使得候鸟千山万水的旅程中找到回家的方向。

作者许静静系德国奥尔登堡大学生物和环境科学学院，动物导航/神经科学研究组博士生，谢灿系中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心、国际磁生物学前沿研究中心（iMFRC）研究员、博导。

部分参考文献：

1.Xu, J., Jarocha, L.E., Zollitsch, T. et al. Magnetic sensitivity of cryptochrome 4 from a migratory songbird. Nature 594, 535–540 (2021).

2.

3.

4.

5.von Middendorf A T. Die Isepiptesen Russlands: Grundlagen zur Erforschung der Zugzeiten und Zugrichtungen der Vögel Russlands[M]. Buchdruckerei der K. Akademie der Wissenschaften, 1855.

6.Schulten K, Swenberg C E, Weller A. A biomagnetic sensory mechanism based on magnetic field modulated coherent electron spin motion[J]. Zeitschrift für Physikalische Chemie, 1978, 111(1): 1-5

7.Ritz T, Adem S, Schulten K. A model for photoreceptor-based magnetoreception in birds[J]. Biophysical journal, 2000, 78(2): 707-718.

来源：中国科学院合肥物质科学研究院