文|书生侃侃谈

编辑|书生侃侃谈

引言

根瘤菌是一类重要的土壤细菌，与豆科植物共生，能够通过根瘤形成与植物建立共生关系，固氮并为植物提供养分，本文研究的目的是探究RgsP和RgsM在根瘤菌生长和细胞分裂中的作用机制，我们关注于研究这两个蛋白质对根瘤菌生长速率、细胞分裂进程以及共生关系的影响。

研究表明，RgsP蛋白在根瘤菌的生长和细胞分裂中扮演着重要角色，通过敲除RgsP基因，我们观察到根瘤菌的生长速率减缓，细胞分裂周期延长，同时细胞形态也发生了变化。

RgsP是正常细胞所必需的

RgsP蛋白由7TMR-DISMED2，7TMR-DISM_7TM，PAS，GGDEF和EAL域组成，之前的系统诱变研究将rgsP确定为梅利洛蒂Rm2011的潜在必需基因，在生长的细胞中，C端带有3×FLAG标记的RgsP积累，但在固定相细胞中仅以非常低的水平检测到，表明RgsP在细胞生长过程中起着作用。

为了进一步了解该蛋白质的功能，我们构建了一个RgsP耗竭的菌株，通过将天然的rgsP基因放置在IPTG诱导型启动子的控制下，使用相同的启动子，我们确认在没有IPTG的情况下成功降低了C末端带有3×FLAG标记的RgsP变体。

Rm2011 rgsP菌株在含有IPTG的情况下强烈依赖于IPTG来进行增长，在添加IPTG的培养条件下，细胞表现出野生型样的生长和形态，然而在去除RgsP的细胞中，细胞失去了杆状形态，并且具有不规则和不均匀的表面，这些细胞中约有4.7%显示为死细胞，经碘化丙啶染色显示。

这表明在没有IPTG的条件下培养24小时后，RgsP耗竭对细菌的生理效应可能主要是抑制细菌生长，为了评估去除RgsP的细胞恢复生长的能力，我们进行了集落形成实验，并在含有IPTG的TY培养基上使用显微镜监测细胞的生长。

在Rm2011 rgsP菌株的培养基中，当在没有添加IPTG的情况下培养12或24小时后，细菌集落形成单位的数量分别降低了67.8%或97.4%，在RgsP耗竭的细胞中，有25.8%的细胞能够恢复并在带有IPTG的TY琼脂糖培养基上产生微小的菌落。

相比之下，只有3.0%的细胞能够在缺乏IPTG的培养基上至少分裂一次，并且在12小时的监测期间没有观察到菌落的形成，RgsP耗竭主要导致细菌生长停滞，仅有少部分细胞在添加IPTG时得到缓解，在解释这些结果时，需要考虑到在耗竭条件下生长的细胞可能含有一些残留的RgsP。

通过使用HADA标记，我们可以可视化PG合成的区域，在诱导rgsP表达的补充IPTG培养物中，98%的细胞在细胞极和/或间隔区域的一侧被HADA染色，相比之下，只有33%的RgsP耗尽细胞掺入HADA。

当RgsP耗竭时，具有可见隔膜收缩的分裂前细胞双联体的比例增加到42%，而在RgsP填充培养物中仅为13%，这些结果表明，在没有RgsP的情况下，细胞壁合成在极性细胞壁合成和细胞分裂的晚期受损。

为了确定RgsP的亚细胞定位，我们用rgsP-egfp取代了其天然基因组位置中的rgsP，在指数生长的S.美利洛蒂细胞中，RgsP-EGFP与HADA标记的PG合成位点共定位在其中一个细胞极和分裂位点，延时显微镜观察显示，RgsP-EGFP在细胞伸长的整个阶段一直保持在极点，直到它重新定位到细胞中部区域。

接下来，我们将RgsP-EGFP与ParB-mCherry同时进行共定位，ParB与靠近染色体复制起源的parS位点结合，在细胞周期的早期，单个荧光ParB-mCherry焦点位于旧细胞极点，而RgsP-EGFP定位在相反的新极点。

后来，第二个ParB-mCherry焦点转移到了新的极点，在新极点上，RgsP-EGFP和ParB-mCherry共定位了一段时间，然后RgsP-EGFP的极性信号消失并出现在细胞中部，这表明，RgsP-EGFP定位在细胞周期早期的新细胞极点，后来定位在细胞分裂位点，而这些位置恰好是PG合成的位点。

为了将RgsP的重新定位时间模式与已知的细胞分裂前过程联系起来，我们对RgsP与早期分裂成分FtsZ进行了共定位，mCherry-FtsZ在生长细胞中显示出漫反射荧光，并在细胞分裂前定位于细胞中部，RgsP-EGFP的隔膜定位总是与细胞中部mCherry-FtsZ焦点的存在一致。

但反之则不然，表明RgsP在间隔部位的积累晚于FtsZ，延时显微镜显示，RgsP-EGFP在mCherry-FtsZ焦点发生后约24分钟定位在细胞中部，这种RgsP-EGFP重新定位后立即出现隔膜收缩，大约24分钟后完成细胞分裂，这表明RgsP可能也具有参与分裂的功能。

相对于PleD，我们通过更高的时间分辨率分析了RgsP在细胞中部重新定位的动态过程，我们之前发现DGCPleD在细胞分裂前的20分钟内定位到新的细胞极，同时追踪PleD-EGFP和RgsP-mCherry表明，PleD-EGFP在生长的细胞极点的积累与RgsP-mCherry信号在极点逐渐消失并重新定位到分裂位点的时间相关，表明RgsP和PleD在新极点的定位相互排斥。

N端结构域不可或缺

为了研究RgsP的功能及其复杂域组织，我们生成了不同的RgsP变体，每个变体都带有或不带有C端融合的EGFP，这些基因变异通过异位表达在RgsP耗竭菌株Rm2011rgsP中进行，检测了所有RgsP变体对于补充RgsP耗竭菌株的细胞生长和形态缺陷的能力，以及EGFP融合蛋白的亚细胞定位。

通过异位表达的rgsP或rgsP-egfp能够恢复RgsP耗竭细菌的生长和细胞形态，且RgsP-EGFP从异位和天然基因位点表达时的定位是相似的。

我们靶向保守抑制位点和GGDEF结构域中的DGC活性位点基序，以及EAL结构域中的PDE活性位点，或去除EAL结构域未显著影响蛋白质的定位和互补能力，缺乏GGDEF结构域或同时缺乏GGDEF和EAL结构域的RgsP和RgsP-EGFP变体无法完全补充生长和形态缺陷，除非它们在P合成的条件下表达。

尽管如此，这些缺乏功能结构域的EGFP标记的版本显示出正常的细胞定位，当通过P*启动子在pABCS2-mob上表达rgsP时，与相应的3×FLAG标记的野生型蛋白相比，变体的水平类似，唯独RgsPΔGGDEF在相应野生型蛋白水平的67%处检测到，这表明缺乏EAL结构域的RgsP可以完全支持细胞生长，而缺乏GGDEF结构域可能会影响蛋白质的稳定性或功能。

为了研究c-di-GMP在RgsP功能中的可能作用，我们测试了RgsP和RgsP-EGFP变体对于c-di-GMP缺陷菌株Rm2011ΔXVI中RgsP耗竭的互补性，该菌株缺乏所有预测编码活性DGC的基因，并且c-di-GMP水平低于检测限。

这些RgsP变体在有或没有c-di-GMP的菌株中的互补特性难以区分，RgsP-EGFP在Rm2011ΔXVI中表现出正常的定位，这表明c-di-GMP不是RgsP定位和该蛋白在细胞生长中的基本功能所必需的。

N端结构域的缺失消除了RgsP补充RgsP耗竭表型的能力，与表达载体无关，当使用P*启动子在pABCS2-mob上表达的rgsP变体分别累积到相应野生型蛋白水平的58%、30%、6%和9%，这些带有EGFP标记的RgsP变体的荧光信号未显示出特征性的极性和隔膜定位。

综上所述，这些数据表明RgsP的N末端部分决定了这种蛋白质的本质性，而EAL结构域对于RgsP的促生长功能是可有可无的。

由于GGDEF和EAL结构域可能具有调节作用，研究人员分析了体外结合c-di-GMP的酶活性和能力，他6-标记的RgsP变体，包含PAS、GGDEF和EAL域水解了-c-di-GMP，而带有PDE活性位点突变的His6-RgsPPAS-GGDEF-EAL-AAL则没有显示出切割产物，在DGC活性测定中，使用GTP作为底物，His6-RgsPPAS-GGDEF-EAL-AAL没有合成c-di-GMP。

与对照相反，阳性对照使用新月属DgcA蛋白，这与RgsP的GGDEF结构域中的简并活性位点GGDQF以及先前的体外DGC活性测定结果一致，表明RgsP片段包括PAS、GGDEF和EAL结构域。

由于完整的I位点RxxD存在于RgsP的GGDEF结构域中，研究人员使用His6-标记的RgsP变体，仅包含PAS和GGDEF域，在该测定中，阳性对照His6-DmxB蛋白产生了特征性的DRaCALA模式，而His6-RgsPPAS-GGDEF无法阻止c-di-GMP，RgsP的PAS-GGDEF-EAL结构域具有c-di-GMPPDE活性，可能由EAL结构域催化，但GGDEF结构域不结合或合成c-di-GMP。

蛋白酶的相互作用

根据实验结果，研究人员使用C末端3×FLAG标记的RgsP变体进行了免疫共沉淀实验，成功鉴定了27个RgsP的蛋白质相互作用伙伴，其中假定的跨膜蛋白RgsM是最丰富的伙伴，并且与RgsP的Co-IP实验进一步支持了两种蛋白质之间的相互作用。

使用跨膜拓扑和信号肽预测工具PHOBIUS分析了RgsM氨基酸序列，建议氨基酸1-31的细胞质定位，短疏水跨膜α螺旋区域和剩余C端部分的周质定位，RgsM的氨基酸508-606代表保守的肽酶M23结构域。

该结构域通常被称为LytM结构域，具有PG内肽酶活性，是锌依赖性金属肽酶的特征，RgsM的LytM结构域包含保守的HxxxD基序，这是金黄色葡萄球菌LytM在葡萄球菌PG肽中甘氨酸-甘氨酸键的锌离子配位和水解所必需的，其余的RgsM氨基酸序列没有提供关于其可能功能的线索，并通过磷酸酶检测测定确认RgsM的周质定位。

RgsP和RgsM之间的相互作用通过细菌双杂交测定法得到验证，在该测定中，假定相互作用伴侣T18-RgsM和T25-RgsM在E.coli中产生功能酶，从而激活lacZ报告基因的表达，实验结果显示T18-RgsM和RgsP∆GGDEF∆EAL-T25融合蛋白以及T18-RgsM和T25-RgsM导致β-半乳糖苷酶活性增加。

表明蛋白质-蛋白质相互作用，RgsM能够与RgsP相互作用并在异源宿主中形成同源二聚体，与Co-IP实验结果一致，支持了RgsP和RgsM在S.meliloti中的相互作用。

结论

研究结果表明，RgsM蛋白同样在根瘤菌的生长和细胞分裂中具有重要功能，RgsM基因敲除后，根瘤菌的细胞分裂周期显著增加，细胞数量减少，且细胞形态出现异常，进一步的研究发现，RgsP和RgsM之间存在相互作用，它们可能在细菌生长和细胞分裂的调控网络中相互影响。

参考文献：

祖米姆·罗姆莫尔，《雕刻细菌细胞》

尼洛尔·大麦，《变形杆菌目根瘤菌的极性生长》

格里根·丘兹，《细菌极性生长的基本特征和模式》