前言：

姜黄素是一种多酚营养保健品，作用于多种生物靶标，包括蛋白激酶 C （PKC）。PKC是细胞内信号转导的核心丝氨酸-苏氨酸激酶家族。

我们发现姜黄素选择性地调节CHO-K1细胞中的PKCα而不是PKCε。为了了解这种选择性的机制并阐明负责姜黄素结合和调节的PKCα结构域的可能作用，制作了几种交换PKCα和PKCε的C1和C2结构域的嵌合蛋白，并研究了姜黄素在HEK293细胞中的调节抑制作用。

域交换突变体的构建

采用pEGFP-N1载体中的野生型PKCα（αWT）和PKCε（εWT）通过PCR重组方法构建<>个结构域交换突变体。

野生型和突变体的结构域结构如图1.突变体被设计为α/εC2，其中αC2被εC2取代，α/εC1，其中αC1被εC1取代，ε/αC2，ε/αC1B，其中εC1B被αC1B取代。突变体中的正确序列通过DNA测序得到证实。

细胞培养

将人胚胎肾293（HEK293）细胞在补充有胎牛血清（FBS）和抗生素（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中培养。将细胞在补充有37%CO的5°C的潮湿气氛中孵育2.HEK293细胞使用脂质®胺LTX和Plus转染野生型和突变质粒™试剂根据制造商的建议。

为了检查蛋白质表达，将转染的细胞在裂解缓冲液中裂解，然后进行细胞裂解物（40-80μg）进行蛋白质印迹分析。

抗GFP抗体（1：1000稀释液）和抗β-肌动蛋白抗体（1：5000稀释液）（Cell Signaling，Danvers，MA）用于免疫印迹中的蛋白质检测。

细胞分离

转染的细胞用不同浓度的TPA和姜黄素处理，如相关图所示。如前所述进行细胞分级分离和蛋白质印迹分析（36）。

简而言之，在含有磷酸盐蛋白抑制剂（Cell Signaling，Danvers，MA）的细胞分级分离缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 7.4）中收获细胞，并通过将细胞通过26G针头10次来裂解。

通过在3500°C下以10rpm离心4分钟除去细胞核和未裂解的细胞。 将上清液在40°C下以000，1rpm离心4小时，以从细胞质中分离出膜沉淀。

该上清液是胞质提取物。将膜沉淀在含有1%Triton-X-100的细胞分级缓冲液中孵育过夜，并通过短暂超声处理均质化。这种超声处理的溶液是膜提取物。对胞质和膜提取物（20–40 μg）进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

用抗GFP抗体和抗β-肌动蛋白抗体探测印迹。使用增强型化学发光试剂（Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY）可视化蛋白质条带，并使用Alpha Imager Gel Document系统进行定量。

共聚焦显微镜

如前所述进行了共聚焦显微镜研究（36）。转染的细胞在玻璃盖玻片（VWR，亚特兰大，GA）上处理或用TPA（10μM）和姜黄素（25μM）共同处理1小时。将细胞固定在4%多聚甲醛中20分钟。

盖玻片安装在含有DAPI的防褪色安装介质中。使用徕卡SP8共聚焦显微镜收集图像。使用ImageJ软件对共聚焦图像中野生型和突变体蛋白的亚细胞分布进行定量。

蛋白质纯化

pET1d载体（Novagen，Madison，CA）中的αC1A和αC28B结构域用于蛋白质表达（37，38）。表达的蛋白质在N末端含有6-He标签。重组质粒转化为BL21金（DE3）细胞。用IPTG（5mM）以0.7的光密度（OD）诱导蛋白质表达，然后让细胞在18°C下生长过夜。

将表达αC1A和αC1B的细胞分别重悬于裂解缓冲液A（50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，50mM尿素，10mM咪唑）和裂解缓冲液B（50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，10mM咪唑）中。

通过超声处理（2分钟，30%振幅，3s开启和3s关闭周期）裂解细胞，并通过在15°C下以000，15g离心4分钟获得可溶性蛋白质。

将提取的裂解物与Ni-NTA结合的琼脂糖珠孵育1小时，然后用相应的裂解缓冲液洗涤以除去未结合的蛋白质。结合的蛋白质在含有300 mM咪唑的裂解缓冲液中洗脱。

使用凝胶过滤缓冲液（75 mM Tris-HCl，pH 10.300，50 mM NaCl）在尺寸排阻柱（Sephadex 8 0/300 GL，GE生命科学，加利福尼亚州麦迪逊）上将洗脱的蛋白质级分合并、浓缩并进一步纯化。蛋白质的纯度通过SDS-PAGE（15%）和考马斯蓝染色测定。

荧光测量

使用配备温度和搅拌控制系统的PTI LPS 220B荧光计进行荧光测量。对于本征荧光测量，缓冲液（1 mM Tris，50 mM NaCl，pH 150. 7）中的蛋白质（2μM）在290 nm处激发，并记录300 nm至500 nm的发射光谱。

对于结合测定，在不同浓度的蛋白质（5-1μM）和TPA（5-1μM）存在下测量姜黄素（10μM）的发射光谱。在每次测量前，将缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2）中的样品混合物在室温下孵育30分钟。

姜黄素在425 nm处激发，发射光谱记录在440 nm至700 nm。最大值（Em.max）的发射光谱由使用IGOR Pro（WaveMatrix，Lake Oswego，OR）的高斯函数拟合确定。

结构预测和验证

PKCα （Uniprot：P17252）蛋白质序列用于使用Robetta蛋白质结构预测服务器（）（3，39）预测40D结构。该服务器根据可用的结构和从头预测方法预测模型。

使用PDB代码分别为1E1、2ELI、2GPE和73IW2的模板生成PKCα的C3A、C3B、C4和激酶结构域的同源模型。使用SAVS服务器验证了总体质量因素，例如共价键距离，键角，立体化学验证，原子命名法和不同原子类型之间的非键相互作用。

分子对接

姜黄素使用Sybyl X 1.1停靠在PKCαC2A和PKCαC1B结构域中。PKCα的模型（在上一节中描述）用于蛋白质结构，并使用ChemBioDraw 12.0生成姜黄素结构。对于对接模拟，Sybyl通过选择3Å半径内的特定残基，为配体的对接空间创建了原摩尔。

使用PKCδC1B（的同源佛波酯结合残基在C1结构域的两个环之间定义配体结合口袋41，42）。阈值0.5和Bloat 4.0用于创建原型。生成原型后，使用Sybyl的Surflexdock Geom模块进行了对接模拟。

分子动力学模拟

在游离PKCα、C1A上含有姜黄素的PKCα、C1B上含有姜黄素的PKCα、C1A和C1B上含有姜黄素的PKCα和C4B上的PKCα含姜黄素的6个模拟系统上进行了分子动力学（MD）模拟。对于MD仿真，选择了显示最高对接分数的构象。

MD仿真是使用GROMACS 5.43.99程序包（44）和Amber45sb力场（3）进行的。姜黄素（CUR）的拓扑和坐标文件由琥珀色工具中的前室程序生成，并使用ACPYPE（46）转换为GROMACS格式。

这些模型由箱距为1.0 nm的TIP48P水分子（973）溶剂化，并通过添加四个Na反离子进行中和。对于游离蛋白质，使用5000，200个水分子来溶剂化系统。使用最陡的下降方法完成能量最小化，300步，以消除在求解系统时产生的空间位阻冲突。

能量最小化后，通过位置约束MD模拟将最小化系统平衡1 ps，以保持系统的温度和压力并松弛溶剂。平衡分两个阶段进行。第一阶段进行了 47 K 的 NVT 优化，第二阶段进行了 300 bar 的 NPT 优化。平衡后，MD生产运行使用Berendsen耦合方法（1）在所有系统中以1 K和0 bar进行，持续48.2 ns。

键长受LINCS算法（49）的约束，允许时间步长为1 fs。粒子网格Ewald（PME）方法（10）用于计算静电相互作用。范德华、静电和库仑相互作用以12 nm截止值计算。为了进行分析，在MD模拟期间，原子坐标每5s保存一次。

采用GROMACS分析工具分析了1个系统的MD轨迹，包括g_energy和g_rms。这些图表由QtGrace绘制。轨迹和结构使用PyMol v7.4（Schrodinger，LLC）和Discovery Studio Visualizer 5.<>（Biovia Inc.）可视化。

突变体在HEK293细胞中的表达

为了检查结构域交换对蛋白质表达水平的影响，通过免疫印迹分析（无花果。2).εWT的表达水平比αWT高2倍。然而，与野生型（αWT和εWT）相比，α/εC1、α/εC2、ε/αC1、ε/αC2、ε/αC1A和ε/αC1B的表达显著降低。

C50结构域交换突变体（α/εC1和ε/αC1）的蛋白表达降低（~1%）。ε/αC1A和ε/αC1B的表达水平与ε/αC1突变体相似。总之，PKCα和PKCε中的C1和C2结构域交换影响了HEK 293细胞的蛋白表达，但所有突变体的表达水平都足以进行膜易位测定。

姜黄素对HEK293细胞中PKCα和PKCε的结构域交换突变体的影响

为了研究姜黄素对突变蛋白的影响，我们测量了在存在和不存在姜黄素单独用姜黄素（25μM）处理对细胞质和膜中野生型和突变蛋白的分布没有任何影响，因为姜黄素处理和对照细胞的细胞质和膜中的蛋白质水平相似。

然而，αWT和εWT在用低至100nM TPA处理后从细胞质转移到膜上，因为我们检测到膜中的大部分蛋白质。这一结果与我们之前在CHO-K1细胞中的报道一致（36）。同样，突变体α/εC1和ε/αC1也在TPA处理后转移到膜上，但与野生型蛋白相比浓度要高得多。

这种浓度的TPA早期被几个PKC研究小组使用（50-52）。此外，在该剂量下，我们没有观察到αWT和εWT的任何超激活依赖性降解（图）。S1）。当姜黄素与TPA共处理时，与单独用TPA处理的细胞相比，膜中αWT的水平显着降低（~50%）。

然而，对于εWT，对于TPA或TPA加姜黄素共处理的细胞，膜中的蛋白质水平相似。相比之下，与单独用TPA处理的细胞相比，TPA和姜黄素的共同处理显着降低了（~40%）TPA诱导的ε / αC1膜易位。

另一方面，当与TPA和姜黄素共同处理时，α/εC1没有显示出TPA诱导的膜易位的任何减少。此外，TPA和姜黄素协同处理对α/εC2和ε/αC2突变体没有任何影响，因为细胞质和膜中的蛋白质水平与对照细胞相似。

综上所述，这些结果表明αC1结构域负责姜黄素对TPA诱导的PKCα和C2结构域交换突变体膜易位的抑制作用，这些突变体对TPA或TPA加姜黄素协同处理不敏感。

姜黄素对TPA诱导的ε/αC1A和ε/αC1B突变体膜易位的影响

PKC的C1域由C1A和C1B子域组成。为了确定姜黄素在αC1结构域中的作用位点并了解αC1A和αC1B亚结构域的作用，我们构建了ε/αC1A和ε/αC1B突变体，其中PKCε的C1A和C1B分别被PKCα的C1A和C1B取代，并使用共聚焦显微镜研究了它们对姜黄素和TPA的易位，如上一节所述（无花果。4一).

姜黄素处理对ε/αC1A和ε/αC1B没有任何影响，因为大多数蛋白质定位于细胞质状对照细胞。但是，ε / αC1A和ε / αC1B突变蛋白定位于TPA处理细胞中的膜。

然而，与TPA处理的细胞相比，用姜黄素和TPA共同处理的细胞在膜中ε / αC30A和ε / αC40B的含量显着减少（1-1%）。这些结果通过细胞分级分离和免疫印迹分析（无花果。4乙).

在该实验中，用不同浓度的TPA（0-10μM）处理细胞，并用姜黄素（25μM）和TPA共同处理1小时。测定细胞质中ε/αC1A和ε/αC1B的含量。TPA处理以剂量依赖性方式降低胞质ε/αC1A和ε/αC1B。

然而，与TPA处理的细胞相比，共处理细胞中细胞质中ε / αC1A和ε / αC1B的含量显着更高。因此，使用共聚焦显微镜和蛋白质印迹分析，我们得出结论，αC1A和αC1B亚域都参与姜黄素的抑制作用。

分子对接和分子动力学模拟

为了从结构角度了解姜黄素在PKCα中的作用位点，将姜黄素对接在全长PKCα结构的C1A和C1B中。以PKC II（PDB代码：3PFQ）为模板的PKCα的简单同源模型无法生成，因为PKC®®II的几个区域在结构中未被解析。

为了了解姜黄素结合的模式，我们将姜黄素对接到C1A和C1B亚域中，然后在1.1 ns内对四个无系统的PKCα、C1A上的姜黄素PKCα、C1B上的姜黄素PKCα和C1B上的姜黄素PKCα和姜黄素进行MD模拟。

对接结果表明，姜黄素与C0A残基形成1个氢键，在C10B中与裂隙残基形成1个氢键，C5A和C0B对接得分分别为5.14和1.1。使用这些 Surflex-Dock 分数估计的 KdC1A和C1B的值分别计算为8.523μM和7.56μM。

势能图显示，在1.0 ns MD模拟过程中，50个分子体系快速稳定并保持稳定，有或没有姜黄素对接的势能相似，并且与C1结构域的类型无关。

C1B上不含配体的PKCα和含姜黄素的PKCα在400 ps时构象变化最大，但C1A上姜黄素PKCα和C1A和C1B上姜黄素PKCα的RMSD值在400 ps后稳定增加。

然而，在1 ns时，与其他三种结构相比，与其他三种结构相比，与姜黄素对接在C1B上的PKCα表现出最低的RMSD。三种结构的 RMSD 值变化如图6B.

结论：

我们实验观察到姜黄素对PKCα活性的抑制作用可能是由于其通过与C2结构域或C1结构域结合而干扰PKCα与膜的结合。

姜黄素抑制佛波酯诱导的PKCε突变体膜易位，其中εC1结构域被αC1取代，但αC1被εC1结构域取代的PKCα突变体没有，结果表明αC1是姜黄素作用的决定因素。