【实验目的】

（1）掌握蓝白斑筛选的原理。

（2）掌握蓝白斑筛选鉴定重组DNA的方法和操作步骤。

【实验原理】

蓝白斑筛选是重组子筛选的1种方法，是在抗生素筛选基础上的第2次筛选，是根据载体的遗传特征筛选重组子。基因工程使用的载体常带有1个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了1个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的作用下，在生色底物X-gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会产生无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料

实验29中转化后加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h的大肠杆菌。

2．实验试剂

（1）X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需过滤灭菌，分装成小包装，避光贮存于－20°C。

（2）IPTG：取2g IPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于－20°C。

（3）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），121℃高压灭菌20min，备用。

（4）抗生素溶液：50mg/mL氨苄青霉素或10mg/mL卡那霉素。

3．实验仪器

超净工作台（每8人1台）

恒温水浴锅（每4人1台）

恒温摇床（全班1台）

台式低温高速离心机（每4人1台）

锥形瓶、玻璃涂棒、培养皿（若干）

1．5mL无菌离心管（若干）

20μL、200μL无菌吸头（若干）

20μL、200μL微量移液器（每2人1套）

【实验步骤】

（1）待LB固体培养基冷却至50°C，加入一定浓度的相应抗生素（pUCm-T载体则加入100μg/mL氨苄青霉素；pET28a载体则加入100μg/mL卡纳霉素），倒入培养皿，凝固后4℃保存。

（2）在预制的含一定量抗生素的LB琼脂平板上，加40μL20mg/mL X-gal和4μL 200mg/mL IPTG溶液，并用灭菌玻璃涂棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布于琼脂凝胶表面。

（3）将适当体积（200μL）已转化并培养的感受态细胞均匀涂在上面的培养皿上，将培养皿放置37℃培养箱中30min，至液体被吸收。

（4）倒置培养皿于37℃培养12～16h，至出现菌落，其中白色菌落为重组DNA质粒。

【典型实验结果分析】

理想实验结果（见图13.3）经12～16h培养后，培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为DNA重组子，蓝色菌落为空载体。

【注意事项】

（1）白色菌落中的重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。

（2）整个操作要注意避免外来DNA的污染。

图13.3　重组DNA的蓝白斑筛选结果及示意图

（3）插入的PCR片段较短（小于500bp），且插入片段没有影响lacZ基因的阅读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

（4）抗生素要在培养在冷却至50～60℃左右才添加，否则会引起抗生素失活。

（5）IPTG和X-gal要涂均匀。a