董绍俊研究员课题组ACB：基于多种类酶活性的Cu3P高效消杀剂：一种对抗抗生素耐药性的催化途径

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第一作者：晁代勇

通讯作者：刘玲副研究员，董绍俊研究员

通讯单位：中科院长春应用化学研究所

论文DOI：10.1016/j.apcatb.2021.121017

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近日，中科院长春应用化学研究所董绍俊研究员、刘玲副研究员在Appl. Catal. B- Environ.上发表了题为“Highly efficient disinfection based on multiple enzyme-likeactivities of Cu3P nanoparticles: A catalytic approach to impedeantibiotic resistance”的研究论文(DOI:10.1016/j.apcatb.2021.121017)。研究了Cu3P NPs作为纳米抗菌剂的性能、机理、与细菌耐药性的关系以及生物安全性，为对抗细菌耐药性相关工作提供研究策略和数据参考。

研究人员制备了 Cu3P NPs 作为纳米抗菌剂，对代表性实验室菌株的敏感型和抗性型、以及实际的渔场水样均显示出高效的抗菌活性（> 99.9%），其抗菌机理依赖于多种类酶活性的协同作用。基于对实际渔场水样的HTS分析，针对性设计抗性细菌和抗性基因的诱导实验，获得Cu3P NPs纳米抗菌剂可以延迟细菌耐药性发生的直接证据。此外，斑马鱼胚胎实验和哺乳动物血液及组织学分析结果表明，Cu3P NPs具有可靠生物安全性。该工作所设计的策略适用于其它对抗细菌耐药性的抗菌材料的研究。

背景介绍

为了克服传统抗生素的耐药性，人们致力于纳米抗菌剂等替代策略的开发。其依据为，纳米抗菌剂很大程度上能够避免传统抗生素的耐药机制。但纳米抗菌剂与细菌耐药性的关系尚未得到充分和肯定的研究，需要更多的科学研究和数据支撑。

本文亮点

(1) 制备了 Cu3P NPs 作为纳米抗菌剂，对代表性革兰氏阴性菌和阳性菌的敏感型和抗性型，以及实际的渔业水样均显示出高效的抗菌活性，抗菌机制依赖于其多种类酶活性。

(2) 设计了针对渔场实际水样的抗性细菌和抗性基因的诱导实验，获得Cu3P NPs纳米抗菌剂可以延迟细菌耐药性发生的直接证据。

图文解析

Cu3P NPs制备和表征

制备CuO NPs前体，经低温磷化形成Cu3P NPs。基于电镜、XRD、XPS等表征和分析，表明成功制备了Cu3P NPs。以OPD为显色底物研究材料的催化性质，结果表明，Cu3P NPs在中性条件下具有类OXD和类POD活性。ESR技术进一步检测到体系中产生了•O2-和•OH（加H2O2）。这些酶样活性产生ROS，具有损害细菌细胞膜完整性的能力，从而预测该材料具有抗菌性能。

Fig. 1 Characterizations and propertiesof Cu3P NPs.(a) TEM image.(b) Dark-field TEM image and corresponding elemental mapping. (c) XRD patterns.(d) OXD- and POD-like properties. (e) Effect of different saturated gases on the OXD-like activity. (f)pH-dependent OXD- and POD-like activities. ESR spectra of the DMPO+Cu3P NPs methanol suspension (g), DMPO+H2O2+Cu3P NPs aqueous suspension (h), TEMP+H2O2+Cu3P NPs aqueous suspension (i).

Cu3P NPs 抗菌性能

通过比较系列金属磷化物，发现Cu3P NPs的抗菌性能最好。通过不同前体CuO和Cu(OH)2制备了五种尺寸的Cu3P NPs，其抗菌活性没有尺寸效应。进一步优化了材料的抗菌剂量和时间，使用1.5 µg/mL和0.5 µg/mL的Cu3P NPs在20分钟内对革兰氏阴性菌E. coli和阳性菌MRSA的灭活效率均达到>99.9%，添加低剂量H2O2，杀菌时间进一步缩短至15分钟。LIVE/DEAD染色实验表明，材料处理过的细菌透性增强。复苏实验表明，30分钟的作用时间可以使细菌完全失活，不可被复苏。

Fig. 2 Antibacterial property of Cu3P NPs. (a) Time-dependent inactivation efficiency of E. coli (3×106 CFU/mL) and MRSA (3×106CFU/mL) treated by Cu3P NPs with the concentrations of 1.5 and 0.5 μg/mL, respectively. Antibacterial properties of Cu3P NPs and the previously reported nanomaterials toward (b) E.coli and (c) MRSA. (d) Fluorescence merge images in LIVE/DEAD assay. (e) TEM images of the bacterial ultrathin sections. Bars: 1 µm.

Cu3P NPs抗菌机理

通过比对实验排除离子释放杀菌的可能性。通过ROS掩蔽剂，证明•O2-起主要抗菌作用（类OXD作用），添加H2O2进一步提高抗菌效率（类POD作用）。Ellman’s量化分析表明，Cu3P NPs耗竭性消耗GSH，削弱细菌的抗氧化能力。MDA试验表明受试菌的LPO水平增加，结合LIVE/DEAD染色实验确定细胞膜的透性提高，这些性质使细菌敏感于ROS依赖的氧化应激作用。因此，Cu3P NPs的抗菌机制为综合效应。

Fig. 3 Antibacterial mechanism of Cu3P NPs. (a) Schematic diagram illustrating Cu3P NPs for MRSA-infected wound healing and fishery disinfection. (b) ROS levels, (c) LPO and (d)GSH/GSSG ratios in E. coli and MRSA for Cu3P NPs treating experiments.

Cu3P NPs 的细菌耐药性研究

水产养殖业不可避免地大量使用抗菌消杀产品，从而会导致ARB和ARG的产生和传播。研究人员首先采用HTS分析，获得渔场耐药基因信息，丰度最高的19个ARG亚型可归为7类，针对性选取代表性抗生素。0.8 µg/mL Cu3P NPs在30分钟内达到完全消杀（>99.9%）。将7种抗生素与Cu3P NPs同步用于杀菌实验，反复提取每一种抗菌剂的临界浓度平板上的菌落，进行多轮次胁迫实验。经过3个周期（代），6种抗生素的临界浓度平板上的细菌存活率显著提高，Cu3P NPs依旧保持其抗菌效力。该结果说明，本研究的纳米抗菌剂能够提供阻止水产养殖业抗生素耐药性的有效策略。

Fig. 4 Bacterial resistance and ARB-inducing experiment. (a) Photographs of the fishery and (b)the top 19 subtypes of ARGs annotated from this fishery water sample. (c)Survival rate of the bacteria from the real water sample treated with typical antibiotics and Cu3P NPs in the first passage. (d) Schematic representation of the ARB-inducing experiment. (e) Survival rate of the bacteria after three passages.

Cu3P NPs的生物安全性

同Cu3P NPs孵育72小时后，斑马鱼胚胎未显示明显变化。CCK-8试验评估Cu3P NPs对MCF-7和HepG2细胞无明显毒性。将Cu3P NPs静脉注射到健康小鼠体内，血液指标无明显变化；组织学分析表明对主要器官无明显毒性。建立MRSA感染的伤口模型，Cu3P NPs和Cu3P NPs/H2O2均显著促进伤口愈合。这些结果表明，Cu3P NPs在所优化抗菌浓度条件下，具有可靠生物安全性。

Fig. 5 Biosafety of Cu3P NPs. (a) Toxic effects of Cu3PNPs on zebrafish embryos. (b) Cell viabilities of MCF-7 and HepG2 cells treated by Cu3P NPs. (c) Blood physiological index injected with Cu3P NPs. (d)Photomicrographs of the major organs stained with H&E after Cu3P NPs treatments.

总结与展望

这项工作不仅提出了一种高效的纳米抗菌剂，而且为纳米抗菌剂在一定程度上比传统抗生素延迟细菌耐药性提供了数据参考，研究策略适用于其他抗菌材料。

通讯作者介绍

董绍俊，院士（TWAS）/研究员，中国科学院长春应用化学研究所。1952年毕业于北京辅仁大学化学系。获得国家自然科学奖3项和省部级奖10项；Khwarizmi国际奖1项；中国化学会电化学委员会“中国电化学成就奖（2015）”；中国化学会分析化学委员会 “电分析化学终身成就奖（2020）”和“中国女分析化学家奖（2015）”；中国仪器仪表学会分析仪器分会“中国化学传感器·雷磁 终身成就奖（2021）”。发表SCI收录论文1,000余篇，他引6万多次，h-指数120。出版专著、专论24部/册，获授权发明专利60多项。在国际学术会议上做大会、专题和邀请报告100多次，在27个国家及香港和台湾地区讲学，报告100多次。培养研究生中，获全国百篇优秀博士论文的3人；获中科院院长特别奖的5人；获中科院优秀奖的14人；以及获全国优秀博士后奖1人。迄今连续8次跨18年获选全球高引用科学家（2002-2019，ISI Web of Science）。

刘玲，博士，副研究员，中国科学院长春应用化学研究所。科研兴趣为应用于环境检测和风险评估的方法学研究以及纳米抗菌剂的研发。开发生化需氧量、水体总毒性、大肠菌群等在线监测新方法，已实现商品化。主持或合作单位主持企业委托项目、中科院、省级和基金委项目4项。以第一或通讯作者在Appl. Catal. B- Environ.、Biosens. Bioelectron.、ACS sensors等期刊发表论文十余篇。