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ＮＭＲ实验数据经ＮｍｒＰｉｐｅ处理

ｐｒｅＱｉ核糖开关的归属来自ＢＭＲＢ数据库

ＴｔｅｐｒｅＱｉ核糖开关没有己有的核磁共振归属

我们制备了一条只含有ＴＹｅｐｒｅＱｉ核糖开关的Ｐ１螺旋序列的ＲＮＡ短链，序列为５’－ＧＧＣＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧ－３’（５’端同样延长了两个Ｇ来促进转录的进行）

通过这条相对于完整的ＴＶｅ核糖开关分子来说比较简单的ＲＮＡ来分步骤的对７Ｙｅ核糖开关ＲＮＡ进行归属

我们将单独Ｐ１螺旋的核磁谱图与完整的７Ｙｅ核糖开关的核磁谱图作对比，并结合不同的核磁共振实验，包括咁－１３（：ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ、２ＤＮＯＥＳＹ、２ＤＨ（Ｃ）Ｎ、３ＤＴＯＣＳＹ和３ＤＨＣＮ实验，完成对他核糖开关的归属

由于ｌｏｏｐ区的延长突变并未改变ＲＮＡ的二级结构，因此野生型２７ｅ核糖开关的Ｐ１和Ｐ１螺旋的归属对于突变体同样适用

—维氢谱实验

所有的核磁共振实验ｂｕｆｆｅｒ均为５０ｍＭＫＨ２Ｐ〇４、５０ｍＭＫＣ１、２ｍＭＭｇＣｈ、ｐＨ６．５，并加入１０％氘水

除了特定实验有不同的浓度之外ＲＮＡ分子的终浓度为１ｍＭ左右，对于／ｚｏ／ｏ态的样品则在退火前加入１．２倍浓度的ｐｒｅＱｉ小分子

一维氢谱实验在２５°Ｃ下于装配了低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振仪器上采集，变温的一维氢谱于装配了常温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振仪器上采集

由于常温探头信号本身就相对较弱，因此在做变温实验时需增加扫描次数来保证信噪比，每次升温之后要让样品在核磁仪器中进行充分的热交换之后再进行实验采集

Ａ３ＲＤＣ实验及分析

ＲＤＣ实验在装配了低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振仪器上采集，实验温度为２５°Ｃ

我们收集了核糖开关ＲＮＡ分子Ｃ－Ｈ键的ＲＤＣ值

如／〇态样品的准备与实验采用的ｂｕｆｆｅｒ与前文提到的一致

由于ＲＮＡ不同的Ｃ－Ｈ有特征的化学位移范围，我们分别针对ＲＮＡ的Ｃｌ’－Ｈｌ’、Ｃ５－Ｈ５和Ｃ６－Ｈ６、Ｃ８Ｈ８、Ｃ２－Ｈ２分三组进行ＲＤＣ实验数据采集

对于／ｚｏ／ｏ态的ＲｓｗｐｒｅＱｉ核糖开关来说共有Ｐ１螺旋部分的２２组ＲＤＣ数据以及Ｐ２螺旋部分的１８组ＲＤＣ数据，对于ｔｏ／ｏ态的ｐｒｅＱｉ核糖开关来说共有Ｐ１螺旋部分的１９组ＲＤＣ数据与Ｐ２螺旋部分的１５组ＲＤＣ数据

我们以未加介质的溶液状态下的ＲＮＡ的Ｃ－Ｈ键耦合值作为对照，并在相同条件下采集加入了液晶介质ｐｆｌ（ＡＳＬＡＢｉｏｔｅｃｈ，产品目录号：Ｐ－１００－ＲＮＡ）［９９］的数据，两者相减获得ＲＮＡ分子各个Ｃ－Ｈ键的ＲＤＣ值

值得注意的是，介质的加入量需要从低到高逐步尝试，直到氘核的裂分值在２－３Ｈｚ左右较为合适，同时要保证样品的信号不会衰减太多

加入介质要充分并缓慢混匀，防止出现过多气泡

最终加入的ｐｆｌ介质浓度在８ｍｇ／ｍＬ左右

ＲＤＣ值的拟合使用Ｘｐｌｏｒ－ＮＩＨ软件包中的ｃａｌｃＴｅｎｓｏｒ模块来进行

我们在后续的计算中将ＲＮＡ的Ｐ１和Ｐ２螺旋视为刚体，且每个单独的ＲＮＡ螺旋都能得到很好地拟合

基于ＲＤＣ实验数据，我们通过Ｘｐｌｏｒ－ＮＩＨ软件包对ＲＮＡ的系综结构进行的解析

在使用Ｎ＝２的系综构象时，其中一个构象通常使用已有结构（／？〇／〇态ｐｒｅＱｄｌ糖开关ＰＤＢ号：２Ｌ１Ｖ；／ｗ／ｏ态糖开关ＰＤＢ号：３Ｑ５０），另一个构象中，Ｐ１与Ｐ２螺旋分别视为刚体，核苷酸连接处视为自由转动

两种构象相对于总体的占比是通过ＳＡＸＳ实验数据分析获得

在进行结构解析时，系统加热至３０００°Ｃ并达到平衡，然后逐渐冷却至２５°Ｃ，在冷却的过程中各个实验约束按照比例加入，如ＲＤＣ、范德华力和其他能量项因子

除了ＲＤＣ约束之外，结构计算还通过经验势优化了二面角参数

优化过程采用不同的随机种子重复２４０次，并从中选择总体和ＲＤＣ能量项最低的系综结构进行进一步分析

核糖开关分子的ＳＡＸＳ实验及分析

用于ＳＡＸＳ实验的ｂｕｆｆｅｒ条件与ＮＭＲ实验所用ｂｕｆｆｅｒ—致

不同温度下（２５－６０°Ｃ）的ＳＡＸＳ数据是在上海国家蛋白质中心的ＢＬ１９Ｕ２线站收集的

所有的ＲＮＡ样品浓度为２ｍｇ／ｍＬ（实际上分别准备了不同的浓度梯度包括１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ等，最终选取数据质量较高的进行分析），以／〇态样品的制备如前文所述

实验中曝光时间为ｌｓ，最终结果是２０帧数据的平均值

实验过程中的温度控制由两个水浴锅来实现，其中一个与金属样品架相连，另一个与吸取样品的毛细管机械臂相连，以尽量减少这个采集数据过程中热损失带来的温度误差

整个装置理论上可以将温度升高到水的沸点之下，但是实际上温度升高时，水溶液汽化严重，毛细管内容易形成气泡，影响样品在检测槽附近的蠕动，数据难以采集

因此我们在保证数据高质量的情况下只能收集６０°Ｃ的散射数据

每个温度下采集ＲＮＡ分子散射数据的前后都会采集一组缓冲液的散射数据作为背景扣除

实验过程中特别是在高温实验过程中要随时观察每一帧实验结果，更重要的是观察样品蠕动是否正常对准检测中心

ＲＮＡ分子的回转半径（Ｒｇ）使用Ｇｕｉｎｉｅｒ近似进行拟合，并且限制ｑＲｇ＜１．３

同样使用ＣＲＹＳＯＬ从ｐｒｅＱｉ核糖开关的已知结构计算理论ＳＡＸＳ散射曲线

成对距离分布函数（ＰＤＤＦ）是由ＡＴＳＡＳ２．８软件包中的ＧＮＯＭ和ＰＲＩＭＵＳＱＴ模块从散射曲线中导出的

对于ＳＡＸＳ实验值与己知的ＲＮＡ结构的理论计算值不符合的情况（ｘ２较大），我们采用系综构象来进行分析

用于计算的初始构象是通过ＭＤ模拟和蒙特卡罗采样方法获得的

对于叩〇态ＲＮＡ分子，我们将其Ｐ１螺旋视为刚体，剩余的部分让其完全自由扭转，从而产生一个假结形成的构象库

对于态的ＲＮＡ分子，Ｐ１和Ｐ２螺旋均视为刚体，赋予ｌｏｏｐ区的核苷酸完全的扭转自由度，以生成螺旋未堆叠的构象异构体库

使用这两种方法为及ｍ或者ｐｒｅＱｉ核糖开关创建的每一个库中包含１００００个构象异构体

荧光滴定实验确定核糖开关与配体的亲和力

焚光滴定实验［剛在ＦｌｕｒｏＭａｘ－４Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＲＩＢＡＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）仪器上完成

ｐｒｅＱｉ配体小分子（（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，产品编号：ＳＭＬ０８０７）使用跟ＲＮＡ相同的ｂｕｆｆｅｒ按梯度配置不同浓度的储液（保证滴定过程中每次加入的配体的量都在５ｐＬ以内以免造成较大的体积误差）

用于荧光滴定的ＲＮＡ分子选用的是野生型和ＡＣ１５截短型突变体核糖开关，以及野生型７Ｙｅ和Ａ１４’延长型突变体核糖开关

经退火之后的ＲＮＡ底物（退火方法见样品制备小节）配置成５０ｎＭ的浓度并加入１０％ＤＭＳＯ，配体的加入量按照０、１０、３０、５０、１００、５００、１０００ｎＭ的浓度逐步加入到ＲＮＡ底物当中，为了保证充分的热交换，每次加入配体ｐｒｅＱｉ小分子之后需要等待５ｍｉｎ让其充分平衡

实验过程中是通过恒温水洛循环系统来实现温度控制

样品分子的荧光强度是通过６４９ｎｍ的波长激发然后检测６５５－８００ｎｍ范围内的荧光发射强度

最后将６５５－７００ｎｍ范围内的峰面积进行积分并相对于第一个点（未加配体时的荧光强度）作归一化处理