最近十年，基于 CRISPR-Cas 系统的基因编辑工具，以其高效、简便等优势成为生命医学领域最前沿的技术之一。

除最早被投入应用的 Cas9 系统，新型 CRISPR-Cas 系统也被不断地发掘和研究，这有力扩充了基因编辑工具箱。

比如，关于 Cas12 和 Cas13 系统的研究，让人们发现了新的基因编辑范式，极大扩展了基因编辑应用的范围（靶点选择、多重基因编辑、分子诊断等）。

而英国生物学家弗朗西斯·哈利·康普顿·克里克（Francis Harry Compton Crick）于 1958 年提出的中心法则（genetic central dogm），是现代分子生物学的基石，即遗传信息从 DNA 到 RNA 最后翻译为蛋白质。

基于此，靶向切割遗传物质 DNA 和 RNA 的 CRISPR 系统，已经被发掘和广泛应用，比如 Cas9 靶向 dsDNA、Cas13 和 Cas12g 靶向 RNA。

然而，对于靶向生命活动最重要的执行者蛋白质的 CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统的研究却并不多见。

俄裔美国生物学家尤金·库宁（Eugene V Koonin）等人，曾通过生物信息分析发现：有一类靶向 RNA 的新型 III-E 亚型 CRISPR-Cas 系统，可能与蛋白酶存在某种关联 [1]，进一步的生化实验表明 III-E 系统的效应蛋白 Cas7-11 可以与蛋白酶 Csx29 互作 [2]。

Cas13 系统，是目前在 RNA 层次进行基因打靶的主要工具。但是，Cas13 系统会产生旁切效应，从而造成脱靶。

相比之下，III-E 型系统对 RNA 的切割更加可控，在哺乳动物细胞进行 RNA 编辑时，也具有较高的活性及较低的毒性 [3]。

综上，III-E 系统不仅具有成为新一代 RNA 编辑工具的潜力，而且具备靶向蛋白质的可能，预示着该系统可能具有新的 CRISPR 应用范式和巨大的应用前景。

一种更高效更安全的 RNA 编辑工具面世

近日，天津医科大学基础医学院生化系教授张恒课题组、联合中科院武汉病毒所研究员邓增钦团队，对该系统从生物化学和结构层面进行了系统性研究。

图 | 张恒（来源：张恒）

在传统的 III 型 CRISPR-Cas 系统中，Cas6 蛋白负责将前体 crRNA (Pre-crRNA) 加工成熟，而在 III-E Cas7-11 型系统中 Cas6 基因是缺失的，这暗示着 Cas7-11 蛋白本身可能具有 Pre-crRNA 加工的能力。

为了探究 Cas7-11 这一神奇的蛋白是如何自加工切割 Pre-crRNA 的，他们首先解析了来源于 Candidatus ‘Scalindua brodae’ 菌株的 SbCas7-11-crRNA 二元复合物的结构，并通过突变实验找到了 Pre-crRNA 的切割活性中心。

这里需要补充说明的是：Pre-crRNA 切割机制的建立，为开发多重 RNA 编辑等带来了可能。而 Cas7-11 效应蛋白具有两个 RNA 酶切位点，分别位于 Cas7.2 和 Cas7.3 结构域。

一般来说，CRISPR 效应蛋白通过酸碱机制，来对靶标核酸进行切割。不出所料，此次实验结果显示 Cas7.3 结构域中，存在一个保守的天冬氨酸残基（D698），而 D698A 的突变几乎消除了第 2 位点的靶标 RNA 切割。

然而，Cas7.2 相应位置的丝氨酸 S457 在突变后，并未对第 1 个位点的 RNA 切割产生影响。

有趣的是，在 Cas7.2 同一催化口袋中的天冬氨酸残基 D547 的突变，完全消除了 Cas7-11 在第 1 位点的切割活性。

更有趣的是，通过同源序列比对发现，在大多数 Cas7-11 同源物中，这两个相应位置上一般只会出现一个酸性氨基酸。

例如，SbCas7-11 是 S457-D547，而来自 Desulfonema ishimotonii 物种的同源蛋白 DiCas7-11，在对应的位置上则是 D429-N518。

因此，在这两个位置上的氨基酸，可能存在功能冗余、功能丧失和功能获得突变。而此次发现也验证这了一假设，这为开发 RNA 切割能力加强版的 Cas7-11 系统提供了基础。

（来源：Nature Microbiology）

据介绍，脱靶效应带来的安全问题、以及分子量大造成的递送问题，是目前基因编辑领域的两个主要瓶颈。

尽管 Cas7-11 具有较高的安全性，然而其分子量相对较大，体内递送存在困难。

因此，基于结构的理性改造，已在 CRISPR 基因编辑领域得到广泛应用。而基于结构信息，研究团队发现 Cas7-11 有一大部分柔性区域，可能并不参与靶标 RNA 切割。

后续的生化实验也证实了这一点，这为 Cas7-11 系统的高效体内递送指明了方向。

接下来的生化实验和结构结果表明：Csx29 蛋白酶确实能和 Cas7-11 效应蛋白直接结合。

而且靶标 RNA 结合之后，Csx29 蛋白酶会发生构象变化，由抑制状态变为激活状态，预示着蛋白酶的活性很有可能得到发挥，并对靶标蛋白进行切割。

因此，该系统可能同时兼具核酸酶与蛋白酶活性，并暗示着一种新型抵抗噬菌体侵染的机制。

确实如此，课题组利用生化手段阐明靶标 RNA 可以激活 Csx29 蛋白酶的活性，而且 Csx29 对蛋白底物的识别和切割具有序列和结构特异性。目前，课题组正对这种 RNA 指导的蛋白酶功能进行深入研究。

图 | III-E 型 CRISPR–Cas 系统工作机制图（来源：Nature Microbiology）

针对已发现的结论，研究团队已经整理为论文，并以《III-E 型细菌 CRISPR–Cas7-11 复合物的结构和功能》（Structure and function of a bacterial type III-E CRISPR–Cas7-11 complex）为题发表在 Nature Microbiology 上（IF 30.96）和《III-E 型 CRISPR 系统中的靶标 RNA 指导的蛋白酶活性》（Target RNA-guided protease activity in type III-E CRISPR–Cas system）为题发表在 Nucleic Acids Research 上（IF 19.16）。

图 | 相关论文（来源：Nature Microbiology）

图| 相关论文（来源：Nucleic Acids Research）

张恒教授和邓增钦研究员为论文共同通讯作者，天津医科大学基础医学院于桂梅博士、研究生王枭燊、张祎、文亚楠和武汉病毒所博士生安启银为共同一作。该研究得到了国家自然科学基金、中国科学院“百人计划”项目的支持。

审稿过程中，论文获得了如下评价：“该研究工作量非常大，而且具有说服力，特别是 RNA 指导的蛋白酶活性非常有趣，对于进一步理解该复合物在细菌天然功能中的作用具有重要意义。”

凭借该系统特殊的切割机制，相比其他切割 RNA 的 CRISPR-Cas 系统，其具有更高的保真性，可以作为一种更高效、更安全的 RNA 编辑工具。

同时，RNA 指导的蛋白酶活性的研究，将 CRISPR 应用范围扩展到中心法则的所有层次，这种新的编辑范式将为体外诊断、RNA 传感检测、体内蛋白质定向打靶或降解提供新的工具和视角。

“被误传为周围‘最用功’的实验室”

在研究中，为了获得不同状态下的 Cas7-11 复合物的原子层面的结构信息，课题组尝试了各种分子克隆和蛋白质操作手段，最终获得了高分辨率的结构数据。

另外，他们根据结构信息，进行了一系列的突变实验和生化实验，来阐明该系统的工作机制，比如确定加工 Pre-crRNA 和 RNA 切割的酶活位点。

最后，其又根据结构和生化信息，对 RNA 指导的蛋白酶活性进行了研究。

在课题刚开展的时候，多数学生们刚进组没多久，各方面操作都不太熟悉，研究进展也很不顺利。这期间，课题组长身体一直不太好，休息了一段时间。

张恒说：“导师不在，学生反而更加努力，最终也取得了突破。这也说明懂得放手，才能成就。”

另一方面，由于实验室刚建立没多久，资金方面也不充足，大部分仪器设备都需要借用。

学生为了协调实验，很多实验不得不在晚上才能进行，个别时候甚至要等到下半夜才能进行实验。“我们实验室因此也被误传为周围‘最用功’的实验室。”张恒说。

在张恒课题组的招聘启事上，他特别提到了生物信息学。当下，生物技术和 AI 技术的结合，从未如此紧密。

他举例说，AlphaFold 的诞生对传统结构生物学的冲击非常巨大，但是这同时也是一种机遇。AlphaFold 自诞生以来已经预测出了超过 100 万个物种中 2.14 亿个蛋白质结构，基本涵盖了地球上所有已知的蛋白质结构。

对于中小型的蛋白，AI 的准确率非常高，可以有效地帮助科研人员进行结构层面的分析。但是，对于大蛋白和结合核酸及小分子的蛋白，AI 预测的准确率会大大下降。

不可否认的是，AI 的出现让科研变得更加简便。例如，在解析晶体结构时，可以直接通过 AI 预测结构后进行分子置换，而无需使用纯化硒代蛋白这一传统方法。

这也促使张恒去研究更有挑战性、更有意思的科学问题。他说：“AI 从某种意义上解放了我们，避免了无重大意义的重复劳动，同时给我们的研究带来了革命性的范式变化。”

比如，在发现 Cas7-11 复合物识别到靶标 RNA 之后，他们又发现 Csx29 会发生构象变化并打开催化口袋。目前，课题组正在对 Csx29 的切割底物进行优化。同时，也在探索基于该系统的体内外应用。

参考资料：

1.Makarova, K. S. et al. Evolutionary classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nature Reviews Microbiology 18, 67-83 (2020).

2. van Beljouw, S. P. et al. The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase. Science 373, 1349-1353 (2021).

3. Özcan, A. et al. Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11. Nature 597, 720-725 (2021).