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单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是引起人类与多种动物李斯特菌病的食源性人畜共患病原体，可穿越肠道屏障，血脑屏障和胎盘屏障。

李斯特菌病主要影响孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者，并且呈现为危及生命的疾病，如母婴李斯特菌病、败血症和脑膜脑炎。

每年由已知食源性病原体引起的死亡中有28%是由李斯特菌引起的，且LM引起的食物中毒导致患者死亡率高达30%。

目前WHO将其列为21世纪四大食源性致病菌之一，对公共卫生安全造成了较大危害。

与LM致病力密切相关的毒力岛(Listeria pathogenicity island， LIPI)包括LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3和LIPI-4。

其中LIPI-1与LM的胞内感染相关，主要由prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB 6个毒力基因组成。

LIPI-2与LM的黏附、侵袭有关，由inlA、inlB和inlC等多个内化素基因组成。

LIPI-3可编码李斯特菌溶血素S，与LM的细胞毒性和溶血性相关。

2016年 Maury等发现LIPI-4是一个高毒力基因簇，最先被认为是CC4克隆群的LIPI-4为第一个与神经系统感染和母胎感染特异性关联的LM毒力因子，但是近两年来发现ST87和ST213等非CC4克隆群分离株都含有LIPI-4的特异基因。

该毒力岛包含6个基因，分别编码麦芽糖-6′-磷酸葡萄糖苷酶、抗转录终止子、与PTS系统相关的未知蛋白、EIIA、EIIB和EIIC，其本质上是一个纤维二糖家族磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate， PEP)磷酸转移酶系统(Phosphotransferase system，PTS)。

有研究表明，PTS糖特异性组分EII不仅能够响应糖的运输，还影响细菌毒力基因的表达。

Aké等发现LM甘露糖-PTS的EIIAB缺失株毒力基因转录水平的上调依赖于PrfA的表达，同时PrfA的活性和毒力基因表达与EII的去磷酸化的水平负相关。

因此，研究LIPI-4 EII以揭示LM的致病机制是很有必要的。

阮婷玉等研究表明LIPI-4的缺失大大降低了对永生化人脑微血管内皮细胞(Human cerebral microvascular endothelial cells， HCMEC/D3)的侵袭和胞间传播能力，进而影响LM的毒力。

而LIPI-4作为LM中最新发现的毒力岛，EII在LIPI-4参与LM致病性机制中发挥的作用尚不清楚。

本研究通过同源重组技术构建LIPI-4中EII(EIIA、EIIB和EIIC)的缺失株、强启动子回补株和天然启动子回补株，研究其对关键毒力因子转录水平及胞内增殖能力的影响，以此来研究EII对LM毒力因子的调控作用，为深入解析LIPI-4在LM感染宿主过程中的机制奠定基础。

LM928由本实验室分离、鉴定及保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pMD19-T(simple)质粒载体购自大连TaKaRa公司；温度敏感型穿梭质粒pKSV7由浙江大学动物科学学院提供；整合型质粒pIMK2由扬州大学生物科学与技术学院殷月兰教授惠赠；永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)购自北京北纳创联生物技术研究院。

脑心浸出液培养基(BHI)和LB培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和庆大霉素购自北京博奥拓达科技有限公司；限制性核酸内切酶(PstⅠ、SacⅠ和XhoⅠ)、高保真DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自大连TaKaRa公司。

DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青链霉素(P/S)购自美国 Sciencell公司；PCR Mix、DL2 000 DNA Marker、质粒小提试剂盒和DNA凝胶产物纯化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、PerfectStart Uni RT&PCR Kit和5K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。

登录NCBI搜索序列号(NC_003210.1)获取Listeriamonocytogenes serotype 4b str. CLIP 80459全基因序列，搜索Gene ID(7703592、7703593和7703594)获取EIIA、EIIB和EIIC基因序列。

利用Primer Premier 5设计相关引物。

其中VΔEII-F/R位于EII基因上游725 bp和下游708 bp， 用于对EII基因缺失的验证；CΔEII-Phelp-F/R为EII基因的扩增引物。

CΔEII-Pnative-F/R为天然启动子与EII基因的扩增引物，其中Pnative为在EII基因上游序列中利用Softberry在线预测的天然启动子。

将引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物名称 Primer name

引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′)

产物长度/bp Length

ΔEII up-F

AACTGCAGATGCTCCTTGCCATGACATTTGAT (PstⅠ)

526

ΔEII up-R

CATTGTCACTACTCCTGATTTTCATTTCCTTTC

ΔEII down-F

GAAAGGAAATGAAAATCAGGAGTAGTGACAATG

411

ΔEII down-R

CGGAATTCTGTAGAAAAGAGATGGCTATC (EcoRⅠ)

VΔEII-F

GTATTTAACTTCATCATGCCA

3 425/1 433

VΔEII-R

AAAACTGGCGCATTCTAG

CΔEII-Phelp-F

AACTGCAGATGAAAGCATTAGAACGATTTCTGTC (Pst Ⅰ)

1 993

CΔEII-Phelp-R

CCGCTCGAGTGTCACTACTCCTTACTTTTCATCC (XhoⅠ)

CΔEII-Pnative-F

CGAGCTCTTGCTTACATGTTCCTTATCATGCT (SacⅠ)

2 524

CΔEII-Pnative-R

CCGCTCGAGTTACTTTTCATCCAAACGCTTATAC (XhoⅠ)

hly-F

CTGAATTCGGCTGTTACTAA AGAGCAGTTGC

749

hly-R

ATGGATCCTTAGCCCCAGAT GGAGATATTTCTA

EII-F

ATGAAAGCATTAGAACGATTTCTGTC

1 993

EII-R

TGTCACTACTCCTTACTTTTCATCC

根据李红欢方法制备LM928感受态细胞。

以LM928基因组为模板，PCR扩增EII基因的上下游同源臂，将电泳凝胶产物纯化后经SOE-PCR获得融合片段，4 ℃过夜连接至pMD19-T(simple)并测序，将测序正确的重组质粒pMD19-T-ΔEII与pKSV7在37 ℃经Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切3 h， 4 ℃过夜连接。

连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，利用引物ΔEII up-F和ΔEII down-R筛选阳性转化子，再经双酶切鉴定正确的重组质粒pKSV7-ΔEII电击转化入LM928感受态细胞中。

阳性电转子接种于含有氯霉素的BHI液体培养基中，120 r/min， 42 ℃振荡培养，每隔5代用引物VΔEII-F/R检测同源重组情况，筛选缺失株。

缺失株在无氯霉素和30 ℃的条件下120 r/min震荡培养，以消除pKSV7-ΔEII质粒。

每隔5代利用引物VΔEII-F/R进行遗传稳定性的检测，将PCR产物纯化回收后测序，测序正确的缺失株命名为LM928ΔEII。

利用引物CΔEII-Phelp-F/R扩增EII基因，与pIMK2经PstⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，利用引物CΔEII-Pnative-F/R扩增的EII-Pnative基因，pIMK2经SacⅠ和XhoⅠ双酶切切除了自身的Phelp，再与双酶切的EII-Pnative基因连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α。

大肠杆菌转化子用引物EII-F/R与CΔEII-Pnative-F/R验证，得到重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative，重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative图谱电转入LM928ΔEII感受态细胞中，经PCR筛选的阳性电转子接种于含有卡那霉素的BHI液体培养基中振荡培养，经PCR与双酶切验证后送测序。

测序正确的强启动子回补株命名为CLM928ΔEII-Phelp，天然启动子回补株命名为CLM928ΔEII-Pnative。

将LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative分别划线，37 ℃静置培养后挑取单菌落于BHI液体培养基在37 ℃和160 r/min的条件下振荡培养12～14 h至OD600值为0.8，细菌悬液按照1∶100的比例接种于20 mL的BHI液体培养基，记为0 h。

且此时4个菌株OD600数值一致，此后每隔2 h吸取样品至96孔板并设置3个平行，酶标仪读取OD600数值，直至OD600数值趋于稳定。

以时间为横坐标，OD600数值为纵坐标，绘制4株菌株的生长曲线。

将HCMEC/D3传代至12孔板中，待细胞融合至90%时(细胞数量约为 5×105个/孔)，PBS洗涤3次，LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative以感染复数MOI=10感染HCMEC/D3(每组3个平行)，感染1 h后更换含有庆大霉素(100 μg/mL)的DMEM培养基以杀死胞外细菌，此时记为0 h。

1 h时后更换为含庆大霉素(10 μg/mL)的DMEM培养基继续培养，分别在2、4、6、8、10和12 h使用PBS洗涤，加入胰酶消化，加入0.02%TritonX-100吹打收集样品，10倍梯度倍比稀释后涂布于BHI固体培养基，37 ℃静置培养24 h， 菌落计数后分析数据。

挑取LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative划线后的单菌落于液体BHI中振荡培养14 h， 8 000 r/min， 4 ℃离心5 min， 收集20 mL菌液，PBS清洗一次，收集的菌液使用液氮研磨，按照细菌总RNA抽提试剂盒进行野生株、缺失株与回补株的总RNA提取，反转录为cDNA。

以cDNA为模板，使用PerfectStart Uni RT&PCR Kit检测EII基因及关键毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB、inlA、inlB和inlC)转录水平，收集数据后采用相对定量方法(2-ΔΔCt)分析并使用GraphPad Prism软件进行作图。

培养传代细胞至75 cm2培养瓶中，待细胞融合至90%时(细胞数量约为1×107个/瓶)，按照1.7的方法感染细胞(每组3个平行)，12 h后用PBS收集细胞，再按照方法进行RT-qPCR试验及数据分析。

采用SPSS 26.0统计学软件，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义；P<0.01表示差异极显著，具有统计学意义。

本研究中所用RT-qPCR引物信息

引物名称 Primer name

引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′)

产物长度/bp Length

RT-gyrB-F

AGACGCTATTGATGCCGATGA

91

RT-gyrB-R

GTATTGCGCGTTGTCTTCGA

RT-hly-F

ATTGCGCAACAAACTGAAGC

110

RT-hly-R

TCGATTGGCGTCTTAGGACT

RT-prfA-F

GCCAACCGATGTTTCTGTATCA

115

RT-prfA-R

TGGTATCACAAAGCTCACGAG

RT-inlA-F

AAAGATATAGGCACATTGGCGAG

91

RT-inlA-R

GACCCGACAGTGGTGCTAGATTA

RT-inlB-F

GTGAAAGAAAAGCACAACCCAAG

94

RT-inlB-R

TCGCCCCGTTTCCAATAATTAT

RT-inlC-F

AAAACCAAGCATCAACAATACT

113

RT-inlC-R

TGTTTTTAGATAACAACGAACT

RT-plcA-F

CAACTAGAAGCAGGAATACGGTAC

116

RT-plcA-R

TGAGTAATCGTTTCTAATACACCTG

RT-plcB-F

TATCAAGCAACAGAAGACATGGT

109

RT-plcB-R

TGACTATTTTCGGGTAGTCCG

RT-actA-F

CGACATAATATTTGCAGCGAC

138

RT-actA-R

CGTGAACTTACTTCACGTGCA

RT-mpl-F

GGCGTTACGCATTATACGC

88

RT-mpl-R

TATTATCCGGTGTGACGTGG

RT-EII-F

GAGATGCCTCTTCCTCGTTT

81

RT-EII-R

GTTCAATACATGCTTCTGCTT

经PCR扩增出EII基因上、下游同源臂，大小为526和411 bp， 经SOE-PCR融合上、下游同源臂，大小为937 bp。

将融合片段ΔEII与pKSV7连接，经双酶切验证，获得937 bp的ΔEII和7 096 bp的pKSV7条带，表明重组质粒pKSV7-ΔEII构建成功。

重组质粒电转入LM928感受态细胞，PCR鉴定出大小为937 bp的ΔEII条带，同源重组过程中使用引物VΔEII-F/R检测出大小为1 433 bp的单一短条带，表明缺失株LM928ΔEII构建成功，继续传20代，每隔5代均检测出大小1 433 bp的单一条带，表明LM928ΔEII具有良好的遗传稳定性。

重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative电转入LM928ΔEII感受态细胞中，使用引物EII-F/R与CΔEII-Pnative-F/R筛选出大小为1 993 bp和2 524 bp的阳性电转子。

此结果表明CLM928ΔEII-Phelp与CLM928ΔEII-Pnative构建成功。

在BHI培养基中37 ℃培养的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative在生长迟缓期、快速生长的对数期和生长平台期生长趋势均无较大差异。

此结果表明EII基因对LM928体外的生长特性无显著影响。

使用LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative感染HCMEC/D3，在2、4、6、8、10和12 h收集样品，涂布于BHI固体培养基，37 ℃静置培养24 h， 菌落计数。

结果显示，LM928ΔEII在8和12 h的细菌载量显著高于LM928(P<0.05)，在2和4 h的细菌载量极显著高于LM928(P<0.01);CLM928ΔEII-Phelp在2、4、6、8、10和12 h的细菌载量比LM928极显著降低(P<0.01);CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h的细菌载量与LM928无显著差异(P>0.05)，在8、10和12 h的细菌载量比LM928极显著降低(P<0.01)。

结果表明EII的缺失使LM928在HCMEC/D3中增殖的细菌载量升高，CLM928ΔEII-Phelp在胞内增殖方面未能恢复至LM928水平，而CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h恢复到了LM928水平。