今天推送的文章发表在Applied and Environmental Microbiology上的“Structural and Biochemical Basis of a Marine Bacterial Glycoside Hydrolase Family 2 b-Glycosidase with Broad Substrate Specificity”，作者为中国科学院南海海洋研究所的龙丽娟研究员。

碳水化合物由二氧化碳转化而来，占海洋生物质的最大比例。它们主要存在于海藻中，作为细胞内能量储存单元、结构性细胞壁成分和细胞外聚合物，占藻类干质量的13%至90%。与包含不溶性纤维素和芳香聚合物木质素的陆生植物不同，海藻细胞壁富含可形成凝胶、高度水合和硫酸化的多糖。己糖醛酸残基，包括半乳糖醛酸(GalA)和葡萄糖醛酸(GlcA)，通常被发现是海藻多糖的组成部分。拟杆菌门是与海藻相关的最丰富的细菌群之一；这些细菌专门通过一种独特的机制来降解聚合碳水化合物，这种机制通常编码在多糖利用基因座(PUL)中。PUL包含编码碳水化合物活性酶(CAZymes)、SusD样表面聚糖结合蛋白和TonB依赖性受体的串联基因。拟杆菌 PUL对给定复杂聚糖的降解需要定制酶，而PUL中的基因组成可以反过来提供有关目标聚糖的结构信息。

β-葡萄糖醛酸酶(GUSs；EC 3.2.1.31)是一组糖基水解酶(GHs)，可水解含有糖苷键的β-葡萄糖醛酸以释放GlcA单元。大多数GUSs被归类为糖苷水解酶家族2(GH2)，其中一些家族表示为GH1、GH79和GH30分子。GH2酶存在于广泛的生命中，但主要存在于细菌中。它们表现出多种催化活性，包括GUS、β-半乳糖苷酶(GAL)、β-氨基葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶(ManAse)和β-半乳糖苷酶(GalAse)功能。GH2 β-糖苷酶是遵循双置换机制的保留酶，但支持其催化和底物选择性的分子决定因素仍然知之甚少。在本文中，作者描述了一种新型细菌GH2酶的酶学特征，即来自海洋藻类相关Aquimarina sp. strain SCSIO21287, i.e的GalA。重组蛋白对β-半乳糖苷酸、β-葡糖苷酸和β-吡喃半乳糖苷具有独特的广泛底物特异性。作者解决了配体结合的AqGalA复合物的晶体结构，并进行了定点突变以确定参与底物识别和催化的成，揭示了支持酶催化多功能性的分子基础，并为GH2酶分解含糖醛酸的碳水化合物提供了见解。

AqGalA是一种具有广泛底物特异性的GH2 β-糖苷酶

AqGalA由624个氨基酸组成，在N末端具有预测的27个氨基酸分泌信号序列，然后是推定的GUS催化结构域。重组AqGalA在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中过表达，没有信号肽，纯化步骤产生10 mg均一酶/升培养物。不同对硝基苯苷底物的酶分析(图1a)表明，AqGalA对对硝基苯基-β-D-半乳糖醛酸苷(pNP-β-GALA)、对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(pNP-β-GLCA)和对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNP-β-Gal)具有活性，而对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-β-GLC)的活性可以忽略不计。使用pNP-β-GalA作为底物，在30 °C和pH 7.0时检测到最大酶活性（图1b和c）。值得注意的是，AqGalA表现出冷适应特性，在10 °C时保持70%的相对活性。pNP-β-GalA、pNP-β-GlcA和pNP-β-Gal的AqGalA kcat/Km值分别为(1.46±0.05)×104 M-1 s-1、(1.11±0.03) 104 M-1 s-1和(1.27±0.17) ) 102 M-1 s-1（表1）。这些动力学结果表明，AqGalA是一种混合GalAse/GUS/GAL，可有效水解葡糖苷酸和半乳糖苷酸，具有相似的催化效率，同时表现出较弱的混杂β-吡喃半乳糖苷酶活性，表明独特的广泛底物特异性。

使用1H核磁共振(NMR)光谱分析了AqGalA对pNP-β-GalA的水解。如图1d所示，酶完全水解10 mM底物，对硝基苯基苷元信号（7.20和8.17 ppm）变为pNP信号（7.00和8.09 ppm）。游离糖醛酸作为β-异头物产生，如在4.86 ppm处出现H1β共振所证明的，并且由于突变旋转，在4.99 ppm处也检测到较弱的α-异头物信号。

AqGalA的结构特征

解决AqGalA晶体结构的初步尝试没有成功。即使在优化结晶条件后，最好的数据集也只能衍射到3.0 Å的分辨率。然后试图用分子置换来解决结构；然而，重要区域仍然无法解释，这很可能是由于灵活的结构特征和低分辨率。因此，与GalA和GlcA进行了共结晶，并以2.4 Å的分辨率成功地确定了GalA复合物中的AqGalA晶体结构（表2）。该结构包含四个属于不对称单元的分子，属于P1211空间群，其低聚模式被观察为“二聚体的二聚化”。尽管如此，与二聚体（-13 kcal/mol）相比，形成该低聚物时的溶剂化自由能增益（DiG）较低（-1.2 kcal/mol），表明四聚体在溶液中不稳定。AqGalA作为“头对尾”二聚体发挥作用（图2a），与来自Bacteroides uniformis (BuGUS-2)的GUS-2的四级结构一致。

拓扑分配显示AqGalA亚基遵循经典GUSs的保守GH2结构域结构，该结构由三个明确定义的结构域组成（图2b）。结构域A（残基Gln28至Pro220）具有9个反平行β链和3个α-螺旋基序，呈现果冻卷折叠并被归类为推定的GH2糖结合结构域。结构域B（残基Ser221至Ile315）显示出GH2免疫球蛋白样β夹心折叠。催化C结构域（残基Glu316到Asp624）折叠成(β/α)8 TIM桶形折叠，这在GH-A家族中很常见。AqGalA完全缺乏在大多数GH2家族成员中发现的额外两个C末端DUF结构域（D和E）。已显示C末端结构域的空间布置增加了GH2酶中结构域排列的差异。与AqGalA一致，人类GH2 GUS和BuGus-1都缺乏D和E结构域，而来自T.maritima的GUS(TmLac)包含驱动八聚体酶形成的第6结构域(F)。在AqGalA的TIM结构域的中心，观察到一个容纳糖底物的小催化袋。值得注意的是，结构域A的第8个和第9个β折叠之间的长loop（Asp189到Val214）参与了催化口袋的形成（图2c），暗示了结构域A和C之间的密切关系，具有在底物识别和催化可能的作用。

活性残基和催化机理

最初通过序列比对和结构比较预测的AqGalA的催化残基Glu436（酸碱基）和Glu524（亲核体）使用E436A和E524A突变体进行物理确认，这些突变体对pNP-β-GalA、pNP-β-GluA和pNP-β-Gal无活性（表3）。Glu436被适当定位以向糖苷氧（O1原子）提供质子，而Glu524适当地准备好对C1进行亲核攻击。这些残留物位于TIM桶的深处，相隔约5 Å（图3a），与GH-A家族成员中的经典Koshland保留机制兼容。因此，如NMR所示，Glu436和Glu524的空间排列与它们作为催化残基在双置换保留机制中的分配完全一致（图1c）。基于先前在GH2家族中提出的模型，作者推测了AqGalA的催化活性：Glu436质子化糖苷氧，伴随着糖苷键的C-O断裂，而去质子化的Glu524通过形成共价糖基酶中间体而起到亲核的作用。

配体结合位点

AqGalA活性位点中的氨基酸侧链有助于与吡喃糖环上的赤道取代基发生许多特定的相互作用（图3b）。GalA的O2原子通过与His372的氢键识别，而O3原子与His337相互作用。三个残基Asp203、Tyr397和Arg579作为O4原子相互作用的桥梁参与了底物结合。在这些接触中最值得注意的是GalA羧基与Arg579、Asn589和Lys591残基的相互作用，它们形成了一个适合GalA羧基的口袋。此外，Trp569的吲哚环与GalA的吡喃糖环平行，提供稳定的疏水相互作用。

考虑到AqGalA对具有不同取代基的β-半乳糖苷酸、β-葡糖苷酸和β-吡喃半乳糖苷的广泛底物特异性，活性位点口袋的六个残基（Asp203、Tyr397、Tyr500、Arg579、Asn589和Lys591）被突变以确定它们在底物识别和催化中的作用。残基突变为具有相似R基团结构的疏水氨基酸。确定并比较了纯化的野生型AqGalA及其突变体对对硝基苯基糖苷的动力学（表3）。所有突变体对pNP-β-GalA和pNP-β-GluA的催化效率(kcat/Km)显着降低，突变的203、397和591位点导致几乎无法检测到活性，表明在己糖苷水解中起关键作用。这些残基很可能通过促进底物定位来参与催化，形成有效的米氏复合物，具有显着降低的 kcat和基本不变的 Km值。值得注意的是，与野生型AqGalA相比，K591M对β-吡喃半乳糖苷的亲和力更高，Km降低了3倍，这表明局部微环境中疏水性的增加有利于C-6羟基而不是羧基结合。

催化特异性的分子决定因素

GH2家族是最大的GH家族之一，包含＞26000个序列，具有10种不同的酶活性。进行了基于氨基酸序列的系统发育分析，表明AqGalA属于GUS家族（图4a）。然而，除了GUS，AqGalA还表现出GalAse和GAL活性。基于详细的结构比较，AqGalA及其GH2同源物在底物结合腔中显示出几个主要的结构差异，这解释了它们不同的催化特异性（图4b）。包括AqGalA的Asn589、Lys591和Tyr500在内的残基与亚位点-1的C-6羧酸盐相互作用并去除或中和C-6羧酸盐的负电荷。这些残基在GH2成员中高度多样化，具有不同的催化功能。此外，N589L和K591M对糖苷的活性要低得多或检测不到（表3）。这些结果支持了糖醛酸基团的结合模式受局部表面电荷控制以增强对含糖醛酸多糖的有效催化反应的观点。

AqGalA的底物口袋与β-半乳糖醛酸酶EtGalAse共享其大部分残基，除了Tyr397，它与C-5羟基相互作用并在EtGalAse中被精氨酸取代。值得注意的是，包含Tyr397的a7和b21之间的环比AqGalA活性口袋中的其他区域表现出更高的B因子值，而所有活性口袋组装环都表现出相似的B因子值。考虑到 AqGalA 和 EtGalAse 底物特异性的显着差异，这些结构信息强化了活性口袋控制酶底物选择性的构象灵活性和更灵活的活性位点有助于更广泛的催化特异性和酶混杂性的假设。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1128/AEM.02226-21

文章链接：