2020年11月22日，国际著名植物生物学与生物技术期刊Plant Biotechnology Journal 在线发表了王道文团队题为“Efficient expression and function of a receptor-like kinase in wheat powdery mildew defense require an intron located MYB binding site”的研究论文，伯小远今天就和大家一起分享这篇文章，跨年的同时顺便学习一点知识，是不是更有收获呢！

受体样激酶在小麦白粉病防御中的有效表达和行驶功能需要一个MYB结合位点的内含子

文章扫盲

小麦品种：文中提到的小麦品种有普通六倍体小麦和四倍体小麦，其中水源11、中国春和小偃54属于六倍体小麦，Stewart属于硬粒四倍体小麦，文中进行遗传转化所用到的品种是Stewart，属于四倍体小麦；

LRK10L-RLKs：LRK10样受体激酶；

TaRLK-R1， -R2和-R3：属于LRK10L-RLKs，对小麦对条锈菌具有抗性作用；

TtdLRK10L-1：本文研究的主角，正体代表蛋白，斜体代表基因，在硬粒小麦品种Stewart中鉴定出来的，在氨基酸序列和一级结构上与LRK10高度相似；

Bgt: Blumeria graminis f. sp. Tritici 的缩写，白粉病致病菌禾苗枯病菌；

MYB-BS：顺式元件，MYB转录因子结合位点；

CL-1、CL-2、CL-3：TtdLRK10L-1 cDNA转基因株系；

GL-1、GL-2、GL-3：TtdLRK10L-1 gDNA转基因株系。

背景介绍

植物已经进化出一种复杂的天然免疫系统来防御病原体攻击，根据功能可以划分为两种形式：病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）触发免疫（（PAMP）-triggered immunity，PTI)和效应触发免疫（Effector-triggered immunity，ETI）。许多植物受体样激酶（Receptor-like kinases，RLKs）已被证明能够感知和处理不同病理系统中入侵病原体的信号。它们通常作为PTI中的模式识别受体（Pattern-recognizing receptors，PRRs），并被特定的病原体迅速激活。根据RD结构域的存在或缺失，植物和动物的RLKs可分为RD激酶和非RD激酶。迄今为止，在水稻和拟南芥等基因组较简单的模式植物中已广泛研究了几种RLKs在病原抗性中的作用。相比之下，RLKs在具有复杂基因组的作物抗病性中的作用方面，进展就少了很多。

小麦白粉病严重降低了全球小麦作物的产量和质量，培育和利用耐禾苗枯病菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici，Bgt）的小麦品种仍然是防治这种疾病最有效、经济和环境友好的方法。LRK10-like RLKs （LRK10L-RLKs）最早在小麦及其亲缘植物中被报道， LRK10蛋白的主要结构包括一个信号肽、一个富含半胱氨酸的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个预测的胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。它们靶向于质膜，属于非RD激酶。LRK10基因的表达受发育和环境两方面的调控。LRK10基因的复杂调控与启动子和内含子区域中存在的大量顺式元件的存在有关，但是目前还没有实验证据来验证这些顺式元件的功能。另外，三种LRK10L-RLKs (TaRLK-R1， -R2和-R3)已被证明对小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici）的超敏感抗性具有积极作用。然而，LRK10L-RLKs是否参与小麦对Bgt感染的防御应答尚不清楚。

综上所述，本研究的主要目的是研究LRK10L-RLKs是否在小麦对Bgt的防御中发挥作用，以及内含子顺式元件是否会影响LRK10L-RLKs的表达和功能。

为了达到以上目的，作者做了如下实验：

TtdLRK10L-1的结构和表达特征

1.1 转基因受体材料选择

作者曾对六倍体普通小麦中的3种LRK10L-RLKs (TaLRK-R1、-R2和-R3)进行了初步的功能分析，由于普通小麦品种（水源11、中国春和小偃54）基因转化困难，为了深化研究，本文作者分析的是适合农杆菌介导的遗传转化的春硬粒小麦品种Stewart的LRK10L-RLKs。

1.2 研究基因的确定

又因为TRITD1Av1G004220在氨基酸序列和一级结构中与LRK10和TaRLK-R1、-R2和-R3高度相似，因此本文将重点放在编码TtdLRK10L-1的TRITD1Av1G004220上，后续的实验都以此基因展开。

1.3 基因结构分析

对于TtdLRK10L-1的结构分析如下：TtdLRK10L-1蛋白包含一个信号肽、一个富含半胱氨酸的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个包含植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶共有的12个亚结构域的胞内激酶结构域（图1）。TtdLRK10L-1的基因组序列有2个内含子和3个外显子，第一个内含子（intron I, 1015 bp）的大小明显大于第二个内含子（intron II, 191 bp）（图2a）。

1.4 核心元件分析与功能预测

在NEW PLACE数据库中分析，在TtdLRK10L-1的两个内含子中发现了多个预测的顺式元件。这些顺式元件可能参与转录因子结合、非生物胁迫反应、组织特异性表达和植物激素诱导。值得注意的是，一个包含一个MYB转录因子识别序列（TAACTG）和两个W-box转录因子结合元件的MYB-BS仅存在于intron I中。

图1. 预测的TtdLRK10L-1氨基酸序列与普通小麦代表性同系物的比较。

两种类型转基因株系的构建和表征

2.1 转基因材料的构建

利用TtdLRK10L-1本地启动子制备了两种转基因Stewart小麦品系。3个独立的纯合子cDNA株系（CL-1、CL-2、CL-3）表达了来自无内含子I、II的cDNA编码序列的TtdLRK10L-1-GFP转基因；另外3独立的个纯合子gDNA株系（GL-1、GL-2和GL-3）表达相同的转基因，但其基因组序列中均含有两个内含子（图2b）。

2.2 转基因材料基因表达鉴定

通过实时TaqMan PCR检测、基因组PCR、RT-PCR和蛋白印迹分析显示，在cDNA和gDNA转基因株系中均存在TtdLRK10L-1-GFP，且转录翻译活跃(图2c)。值得注意的是，TtdLRK10L-1:GFP在GL-1、GL-2和GL-3中的蛋白水平高于CL-1、CL-2和CL-3（图2c）。

2.3 转基因材料基因亚细胞定位分析

共聚焦显微镜显示TtdLRK10L-1:GFP均靶向cDNA和gDNA转基因株系叶片表皮细胞的质膜（图2d）。与这一发现相一致的是，小麦叶肉原生质体中表达的TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白位于质膜中。

图2. TtdLRK10L-1基因组序列及两种转基因植株的鉴定

(a) TtdLRK10L-1相对于LRK10、TaRLK-R1、-R2和R3的外显子和内含子结构。(b)转化过程中T-DNA区域的构建示意图pNP:TtdLRK10L-1 cDNA -GFP（上）或pNP:TtdLRK10L-1 gDNA -GFP（下）。（c）转基因苗在基因水平、转录水平和蛋白水平上的检测。 (d) TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白在cDNA和gDNA转基因株系叶细胞质膜上的靶向作用。

gDNA转基因株系具有更高的基因表达和更强的Bgt防御

3.1 TtdLRK10L-1 基因受接种Bgt 表达上调（分子原因）

在cDNA和gDNA转基因株系的苗期接种Bgt，通过RT-PCR和Western blot在转录水平（图3a）和蛋白水平（图3b）的定量检测，显示内源性TtdLRK10L-1在Bgt 感染后逐渐升高。并且三个gDNA系（GL-1、GL-2和GL-3）上调幅度更大。

3.2 菌落数量（直观结果）

Bgt接种72 hpi后，cDNA和gDNA转基因株系的Bgt微菌落数量均低于对照组（野生型Stewart和TNS） （图3c）。与野生型 Stewart和TNS相比，6个转基因株系接种后第7天叶片上的Bgt菌落也有所减少（图3d和e）。重要的是，GL-1、GL-2和GL-3的Bgt生长始终显著低于CL-1、CL-2和CL-3（图3c、d和e），说明3个gDNA转基因株系比3个cDNA株系发生了更强的Bgt 防御。

Bgt 部分穿透（a型）或Bgt感染整个细胞（b型）的氧化爆发构成了宿主细胞白粉病感染强防御的重要早期过程。用3，3’-二氨基联苯胺（DAB）对H2O2的积累进行组织学染色，可以有效检测到这两种类型的氧化爆发（图4a）。

在24 hpi时，野生型Stewart和TNS对照植株中出现这两种氧化爆发的细胞比例最低，cDNA转基因株系居中，gDNA转基因株系最高；另一方面，野生型Stewart和TNS对照植株中未氧化爆发的细胞（c型）的百分比最高，cDNA转基因株系居中，gDNA转基因株系中最低（图4b）。

图3. TtdLRK10L-1 cDNA （CL-1， -2，和-3）和gDNA （GL-1， -2，和-3）转基因株系对白粉病（Bgt）感染反应的比较分析

（a）qRT-PCR检测TtdLRK10L-1-GFP基因在Bgt接种前(0 h)和Bgt接种后两个时间点（24 h和48 h） cDNA和gDNA转基因株系中的表达水平。(b)用GFP特异性抗体免疫印迹法检测6个转基因株系TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白。（c）测定6个转基因株系和两个对照材料野生型 Stewart和转基因无效分离苗（TNS）接种后72 h Bgt萌发孢子总数中形成的微菌落百分比。（d）接种7天后，Bgt菌落在6个转基因株系和2个对照（野生型 Stewart和TNS）的叶片表面发育情况。(e)对（d）中不同叶片样品，使用ImageJ对Bgt菌落的叶面积百分比进行量化。

图4. Bgt诱导的cDNA （CL-1， -2, and -3）和gDNA （GL-1， -2, and -3）转基因株系及两个对照材料野生型 Stewart和转基因无效分离苗（TNS）在病原菌接种48 h后的氧化爆发分析。

(a) 3,3 -二氨基联苯胺染色显示的三种类型的细胞氧化爆裂。a型，Bgt部分穿透氧化爆发；b型，氧化爆发分布在整个细胞；c型，没有检测到氧化爆发。(b)定量比较转基因和阴性对照中a、b、c型细胞氧化爆发的比例。

intro I对TtdLRK10L-1介导的Bgt 防御的影响

4.1 根据上面的结果进行猜想

前面的结果显示，3个gDNA株系的TtdLRK10L-1- GFP 转基因表达量高于3个cDNA株系，Bgt 防御能力强于3个cDNA株系，提示内含子可能参与了TtdLRK10L-1 的表达和功能调控。

4.2 对猜想进行验证

为了检验这种可能性，将TtdLRK10L-1的cDNA编码序列和基因组ORF，以及只有intron I、intron II、具有突变MYB结合位点的intron I（intronI/mMYB-BS）或具有两个W-box元件突变的intron I（intron I/mW-box）（图5a），构建到pHZ206载体上，在一周龄Stewart幼苗的叶片中进行单细胞Bgt防御试验。

4.3 结果

瞬时转化细胞中的Bgt Haustorium指数（HI）是防御Bgt感染的有效指标。如图5b所示，pHZ206（VC）和pUbi：TtdLRK10L-1intron II的HI值最高，而pUbi：TtdLRK10L-1gDNA、pUbi：TtdLRK10L-1intron I和pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box的HI值最低，pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box的HI值为中间值。

4.4 结论

这些数据表明，缺乏intron I（如pUbi：TtdLRK10L-1intron II）可大幅度降低TtdLRK10L-1介导的Bgt防御，去除intron II（pUbi：TtdLRK10L-1intron I）或突变intron I中的W-box （pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box）对TtdLRK10L-1在Bgt 防御中的功能没有显著影响，而突变intron I中的MYB-BS（pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS）进一步削弱了TtdLK10L-1 对Bgt 防御的促进作用。

图5. 用单细胞Bgt防御实验分析内含子参与TtdLRK10L-1的表达和功能。

(a)实验中TtdLRK10L-1的WT和突变ORFs的结构图。 (b)在单细胞Bgt防御试验中表达WT和TtdLRK10L-1突变ORFs所赋予的Haustorium指数值。

TtdLRK10L-1 intron I中的MYB-BS增强了

超级启动子活性

5.1 实验方法

利用T-DNA载体SP1300:LUC，该载体携带一个超级启动子驱动的LUC报告基因，利用该载体构建所需要的载体。构建到载体中的结构包含TtdLRK10L-1gDNA、TtdLRK10L-1cDNA、TtdLRK10L-1intron I、TtdLRK10L-1intron II、TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS或TtdLRK10L-1intron I/mW-box上，并且它们都位于LUC的上游。载体构建好之后进行注射烟草实验。

5.2 结果

在第一组中，比较了SP：TtdLRK10L-1cDNA-LUC、SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC、SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron II-LUC的LUC信号（图6a和d），表明intron I的存在（如SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC和SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC）是必要的，具有更高水平的LUC信号。

在第二组中，比较了SP：Ttd LRK10L-1cDNA-LUC、SP：Ttd LRK10L-1gDNA-LUC、SP：Ttd LRK10L-1intron I/mMYB-BS-LUC或SP：Ttd LRK10L-1intron I/mW-box-LUC产生的LUC信号（图6b和e），表明SP：Ttd LRK10L-1gDNA-LUC产生的较高LUC信号需要MYB-BS的存在，而不是W-box元件。

在第三组中，对来自SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC、SP：TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron I/mW-box-LUC的LUC信号进行了评估（图6c和f）。这个组合的结果，以及在第二个组合中获得的结果（图6b和e），证实了MYB-BS，而不是W-box元件，在SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC产生更高的LUC信号方面的重要性。

5.3 结论

TtdLRK10L-1 intron I中的MYB-BS增强了超级启动子活性。

图6. 在本氏烟叶片中利用LUC报告基因分析TtdLRK10L-1内含子I中假定的MYB结合位点(MYB- bs)对超启动子活性的影响。

(a-c)超级启动子（SP）驱动WT或TtdLRK10L-1突变ORFs产生的LUC信号。(d-f)分别对(a)、(b)和(c)中所示的测定产生的LUC信号进行定量分析。

本篇文章到这里就结束了，是不是非常简单，整体的思路就是找到一个基因——分析结构、预测功能——转基因验证，如此简单的套路我不信你不会，今天分享的这篇文献主要目的是想让大家了解内含子的功能，因为很多时候它总是被我们忽略，这只是冰山一角，更多的还需要大家去发现哦！

下面列举了几个关于内含子的研究，有兴趣的同学可以去看看哟！

对于真核生物来说，从DNA新转录的前体mRNA含有内含子和外显子序列，通过RNA剪接的过程切除内含子，剩余的外显子序列连接在一起以形成成熟mRNA，然后将其翻译成蛋白质。这也是真核生物编码基因和原核生物编码基因最大的区别。

之前的研究通常认为内含子是外显子连接的可有可无的副产物，因为它们在剪接后迅速降解。

但是切除内含子、连接外显子，这一过程非常复杂精确。而且更高等的生命内含子更多，如果内含子仅仅作为可有可无的副产物，显然不符合进化的规律。

2019年1月16日，Nature杂志同期在线发表了两篇关于内含子的研究论文。这两项研究都很好地证明了内含子在营养不良条件下的重要性。内含子对于细胞在营养匮乏的培养稳定期的生存是必要的，而且与内含子所在的基因编码的蛋白质无关。

2020年11月22日，Plant Communications杂志在线发表了关于含有内含子的Cas9能提升基因编辑效率的论文。该论文发现对编辑效率最重要的影响是通过在Cas9编码序列中增加13个内含子，这可以极大地提高编辑效率。用不含内含子的Cas9获得的初代转化体都没有表现出敲除突变体表型，而用含有内含子的Cas9产生的初代转化体中，70%-100%显示了突变表型。这种包含内含子的Cas9基因在烟草和长春花属等其他植物中也被证明是高效的。

Happy ending

曾经2020还是小学作文里遥远的未来，如今也只剩最后一天了，这一年我们终究还是挺过来了，感谢挺身而出的英雄、感谢默默无闻的守护，所有的不容易都将成为过去！2021年未来可期，伯小远陪你一起跨年啦！以后你不想看的文献伯小远帮你看，不想做的实验伯小远帮你做！最后祝大家：新的一年心想事成、大吉大利、牛转乾坤！