文/农人贾老师

编辑/农人贾老师

介绍

菊粉是一种储存碳水化合物，主要存在于耶路撒冷洋蓟、菊苣、大丽花和雪莲等植物的根和块茎中，干块茎中菊粉的含量可高达50%。

Parker(2010)描述了用菊糖生产果糖的过程，菊糖是一种果聚糖，由b-2,1连接的聚果糖线性链和末端葡萄糖单元组成，是用于食品和药品的果糖和低聚菊糖的潜在来源。

通常，果糖作为果糖玉米糖浆(HFCS)是由玉米淀粉制成的。高果糖玉米糖浆是酶促产生的玉米淀粉，最初是果糖和葡萄糖。

因此，葡萄糖被葡萄糖异构酶异构化，最终以高达95%的最高产率产生果糖。然而，有报道称，通过直接转化果聚糖多糖或菊糖来生产果糖和/或低聚菊糖的单一工艺。

果糖是天然糖中最甜的，也是蔗糖的替代甜味剂;与蔗糖相比，果糖的升糖指数较低，经常被推荐用于糖尿病患者。

低聚低聚糖是低热量饮食中的功能性甜味剂，也是食品制剂中膳食纤维的来源。

果糖和低聚菊糖都可以通过菊糖外酶(b- d -果聚糖水解酶，EC 3.2.1.80)的酶促作用从菊糖中产生，单独作用或与菊糖内酶(2,1-b- d -果聚糖水解酶，EC 3.2.1.7)协同作用。

将菊粉化学水解为果糖是可能的，但会产生不需要的副产物和色素，因此使用廉价生产的微生物菊粉酶从菊粉中生产果糖和菊粉低聚糖是首选的，因为菊粉的酶解可以产生高达95%的纯果糖。

菊糖酶根据其对菊糖的作用方式分为外链和内链菊糖酶，其中外链菊糖酶通过连续分离蔗糖、棉子糖和菊糖中的末端果糖单位来释放果糖。

而菊粉内切酶则随机作用于菊粉的内部环节，释放出菊粉三糖、菊粉四糖和菊粉五糖为主要产物。

菊粉酶是由马氏克卢维菌、曲霉、葡萄球菌、黄单胞菌和假单胞菌等微生物产生的。

菊芋(Helianthus tuberosus)块茎是菊粉的主要来源。菊芋块茎菊粉的聚合度在2 ~ 60之间，或更高。

利用从真菌和酵母中提取的菊粉酶对菊芋菊粉生产果糖进行了优化。之所以使用来自两种微生物来源的粗菊粉酶的混合物，是因为之前的研究表明，来自不同微生物来源的粗酶具有不同的外链和内链菊粉酶活性比例(Sirisansaneeyakul，2007a)。

因此，混合这两种来源的酶可以优化反应混合物中两种类型活性的比例，从而提高菊粉的水解速率，并使聚合物更完全地转化为果糖。

材料和方法

2.1.菊粉粗酶的制备

黑曲霉TISTR 3570的接种物是通过将一圈孢子无菌转移到含有以下物质(每升0.1 M McIlvaine缓冲液，pH 5.0)的30mL液体培养基(1×105个孢子/mL)中制备的：菊粉10 g，酵母提取物12 g和MgSO4·7H2O 2g。Erlenmeyer烧瓶在30 C的旋转激振器上以200 rpm孵育24小时。

每体积(v/v)接种量(30ml) 10%的体积转移到500mL的烧瓶中，每个烧瓶含有270ml上述指定的液体培养基。按上述规定对烧瓶进行孵育。将这些培养物接种到5l搅拌罐式发酵罐(Biostat B;B. Braun Biotech International;Melsungen, Germany)，含2.7 L以上规定的新鲜培养基。

表1

发酵罐在30 ℃下运行48小时，搅拌速度为600 rpm，曝气速度为每分钟1容器容积。

pH值和溶解氧水平没有得到控制。然后收获肉汤并过滤(Whatman 1号滤纸;绘画纸PLC；Maidstone, UK)去除生物质，滤液直接用作粗真菌菊粉酶。

将生长在琼脂倾斜上的酵母一圈接种到30mL的液体培养基中，初始光密度为0.1，接种于600nm处，制备了guilliermondii TISTR 5844的酵母接种物。

如上所述，为黑曲霉培养酵母，在4 ℃下离心(10,000×g, 20 min)回收发酵液上清，将上清液直接用作粗酵母菊粉酶。

表2

2.2.洋蓟提取物的制备

耶路撒冷洋蓟块茎来自泰国Kasetsart大学农学院Petchaboon研究站。

用自来水冲洗，剥皮，在100℃下蒸15分钟，将1公斤煮熟的块茎在1升热水中粉碎成细浆，提取菊粉。

得到的浆液通过双层薄纱布过滤。该提取物含有约100克/升总碳水化合物和2克/升还原糖。过滤后的提取液在4℃下离心(10,000×g, 30 min)。

将回收的上清液在真空度为72±3 mm Hg、温度为45℃的旋转真空蒸发器中浓缩至总碳水化合物含量为370 g/L。

浓缩液在62±2 ℃下保温30分钟进行巴氏消毒，该浓缩液用作生产果糖的底物。

表3

2.3.实验设计

实验因素为：反应混合物中混合酶活性(A)、混合酶中真菌与酵母菊粉酶活性的比值(B)、反应混合物的初始pH (C);培养温度(D)、和反应时间(E)。

实验设计的Taguchi L16正交阵列表，由五个因素在四个水平组成，如表4所示(Roy, 2001)。

实验数据使用Qualitek-4软件用“越大越好”的质量标准来确定从菊粉中生产果糖的最佳条件，有关的统计处理已在前面讨论过。

表4

2.4.批量生产果糖

在250mL摇瓶中以表5所示的因子水平进行了16个批次的果糖生产实验。每个摇瓶含有50ml耶路撒冷洋蓟提取物和0.1% (g/ 100ml)苯甲酸。

在200 rpm的摇床转速下，在不同温度下(表1)培养烧瓶。在适当的孵育时间后，对烧瓶进行取样(表5)。

样品通过煮沸10分钟淬灭，离心(10,000×g, 10分钟)，并使用高性能阴离子交换色谱脉冲安培检测(HPAEC-PAD)分析上清中果糖和果糖/低聚果糖。所有的实验都是一式三次进行的。

表5

2.5.分批进料生产果糖

利用间歇式生产数据确定的最佳工艺条件指导了进料间歇式实验中果糖的生产。

投喂菊粉提取物和长时间孵育导致的反应混合物中酶活性下降，每2-6个小时可通过间歇性地投喂混合菊粉酶来弥补。

将菊芋浓缩液分别饲喂20、40、60和84小时，最终总碳水化合物浓度分别为150 g/L、220 g/L、340 g/L和320 g/L，用HPAEC-PAD分析了淬火反应样品中的糖和低聚果糖/低聚菊糖。

表6

2.6.酶化验

2.6.1.菊粉酶的活动

粗酶提取物用0.05 M McIlvaine缓冲液在pH 5.0下稀释至所需水平。在上述缓冲区中将稀释后的提取物(0.5mL)与每体积重量0.5% (w/v;g/ 100mL)制作菊粉(菊苣根菊粉。

将混合物在40℃下孵育30分钟，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法(Miller, 1959)和果糖标准曲线测定所产生的还原糖。

菊粉酶活性的一个单位定义为在0.5 M McIlvaine缓冲液中加入0.5% w/v的菊粉标准溶液，在pH 5.0和40 C下，每分钟释放1mmol果糖的量。

表7

2.6.2.蔗糖酶活性

粗酶提取物用0.05 M McIlvaine缓冲液在pH 5.0下稀释至所需水平。在上述缓冲区，将稀释后的提取物(0.5mL)与1mL 0.5% w/v蔗糖(分析级；Ajax Finechem 500)。

将混合物在40℃下孵育30分钟，并分析还原糖，如前所述的菊粉酶测定。一个单位的转化酶活性被定义为在上述条件下每分钟从蔗糖中释放1mmol果糖(或葡萄糖)的量。

2.6.3.分析方法

采用苯酚-硫酸法(Dobois, 1956)以果糖为标准测定耶路撒冷洋蓟提取物(任何水解之前)的初始总碳水化合物。

菊粉的浓度计算为菊粉水解产生的果糖的91%(聚合度；DP > 2)，如Raessler(2008)所述。

用HPAEC-PAD对酶促反应产物进行了分析，使用Dionex BioLC色谱仪(Sunnyvale, CA, USA)。

色谱仪配备ED 50脉冲电化学检测器，工作电极为金，参比电极为氯化银。

葡萄糖(Ajax Finechem A783；Auburn, NSW, Australia)，果糖(Ajax Finechem A775)，蔗糖(Ajax Finechem 500)，1-kestose，nystose (Wako 292-64121)和1F -构呋喃基nystose (Wako 299-64131)作为鉴定水解产物的标准，DP值分别为1-5。

结果与讨论

基于先前报道的使用混合菊粉酶从菊粉中产生果糖的研究，以菊粉作为底物优化混合菊粉酶时，影响果糖产生的因素和水平。

表1

16次实验的最终果糖浓度、产率和生产率值如表1所示，实验运行12(表1)产生了最高的果糖浓度(39.8±3.2 g/L)和产率(2.15±0.17 g/L hr)，低聚糖产量约为2.22±0.39 g/L。

对于本次运行，因子设置为：混合酶浓度为4 U/g底物，真菌/酵母酶菊粉酶活性比为25:1，初始pH为4.5，40℃;反应时间为18小时。

第14批次的果糖产量最高(0.58±0.07 g/g)(表1)，对于第14批次，因子设置为：混合酶浓度为5 U/g底物，一个菊粉酶真菌/酵母酶活性比为15:1。

初始pH为5.0，40℃，反应时间为24小时。此外，还检测到少量的低聚菊糖(0.77±0.14 g/L)。

果糖浓度、产量和生产率的峰值均为最低值的6 ~ 15倍，所得低聚糖(DP 3e5)均在0.77 ~ 19.53 g/L范围内(数据未显示)。

表2

表1中的数据使用Qualitek-4软件进行处理，选择越大越好属性，以确定果糖生产的最佳条件。

表2总结了指定水平上各因素对果糖生产的主要影响，表2还提供了各因素对果糖浓度、产量和体积生产率的主要影响百分比。

主效应是每个因子水平上因子平均值的最大值和最小值之间的差异，一个因子的百分比主效应是其主效应的百分比除以所有因子的主效应之和。

百分比主效应值(表2)表明，所有因素(A-E)对果糖的浓度、产量和生产率都有显著影响。在考虑的五个因素中，混合酶浓度(因素A)、温度(因素D)和反应时间(因素E)对果糖产量的影响最大。

表3

反应时间和混合酶浓度是影响果糖浓度和产率的最主要因素(占主要影响的62-63%)。混合酶浓度和温度对果糖产量的影响最大(约66%的主效应)(表3)。

菊粉酶活性比(因子B)和pH(因子C)对果糖产量的影响较小(各约8-12%的主效应)。然而，正如本工作后面所讨论的，菊粉酶的活性比是影响菊粉水解产物组成的重要因素。

参考文献

1.Chi, Z.M., Zhang, T., Cao, T.-S., Liu, X.-Y., Cui, W., Zhao, C.H., 2011.菊粉在生物工艺中的生物技术潜力. Bioresour. Technol. 102, 4295-4303.

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3.Dobois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A., Smith, F., 1956.糖和有关物质的比色法测定. Anal. Chem. 28, 350-356.

4.Jing, W., Zhengyu, J., Bo, J., Augustine, A., 2003.无花果曲霉胞外酶的生产与分离. Proc. Biochem. 39, 5-11.

5.Kango, N., Chand Jain, S., 2011.微生物菊粉酶的制备及其性质研究进展.Food Biotechnol. 25, 165-212.