人参（PanaxginsengC.A.Meyer）是我国极具特色的传统中草药，也是现代医药发展中不可或缺的重要原料。人参因其含有人参皂苷、多糖及氨基酸类等多种活性成分，具有抗肿瘤、调节机体免疫力、抗肥胖、抗糖尿病和缓解衰老等多重功效。

此外，还包含多肽、挥发油、脂肪酸、无机盐和维生素等不同类型化合物，亦是其发挥药效的重要物质基础。

在炮制过程中，由鲜人参经加工炮制而成的生晒参、大力参、红参和黑参等，是目前较为常见的人参炮制品。

但值得注意的是，在蒸制和烘干过程中，人参内在成分会发生较为复杂的化学反应，不仅使人参皂苷发生糖苷键断裂和脱水异构化，而且还会促使人参中氨基酸及还原糖发生梅拉德反应（Maillardreaction，MR），即含羰基化合物（人参中的还原糖）与氨基化合物（人参中的氨基酸、多肽和蛋白质等）发生缩合、聚合反应，从而生成多种梅拉德反应产物（Maillardreactionproducts，MRPs）。

为探究人参炮制过程中发生MR的程度，本研究以同一批鲜参加工而来的生晒参、大力参、活性参、红参和黑参五种炮制品为原料，利用HPLC法探究人参不同炮制品中氨基酸和还原糖的含量变化，以期为初步揭示人参加工过程中MRs的产生提供理论参考。

材料与仪器

实验材料

人参炮制所用的鲜人参原料购自于吉林省万良人参市场（吉林，抚松），单根重为80~100g5年生的新鲜人参。其生晒参、大力参、活性参、红参和黑参等炮制品，为实验室自制，其具体加工方法和参照标准如下表所示：

实验试剂

色谱级甲醇、乙腈（默克Supelco），购自于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；分析级甲醇、乙醇，购自于山东创达化工有限公司（中国，山东）；娃哈哈纯净水，购自于杭州娃哈哈集团有限公司（浙江，杭州）；丙酮、乙醚、苯酚，购自于南京宁康化工有限公司（江苏，南京）浓硫酸（98.5%），购自于辽阳禄晟化工有限公司（辽宁，辽阳）。

氨基酸系列标准品：天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）；氨基酸衍生试剂A和衍生试剂B溶液，色谱级，购自于上海月旭科技股份有限公司；

还原糖系列标准品：鼠李糖（Rha，CAS.6155-35-7）；葡萄糖醛酸（GlcA，CAS.6556-12-3）；麦芽糖（Maltose，CAS.69-79-4）；D-葡萄糖（Glu，CAS.50-99-7）；D-半乳糖（Gal，CAS.59-23-4）；阿拉伯糖（Ara，CAS.10323-20-3），购自于上海抚生实业有限公司。

实验仪器

欧橡（OAK）C949-304不锈钢中药粉碎机，购自于浙江欧橡机械材料有限公司（浙江，杭州）；

TYHD-600超声波清洗机，购自于北京天佑恒达科技限公司（中国，北京）H2500R型台式高速冷冻离心机，购自于湘仪离心机仪器有限公司（湖南，长沙）；

MZMQ蒸汽型高压蒸汽灭菌器，购自于湖南共创医疗设备有限公司（湖南，长沙）；CS-115M烘干法水分测定仪，购自于深圳市冠亚技术科技有限公司（广东，深圳）；

101A-2型电热鼓风干燥箱，购自于爱来宝（济南）生物技术有限公司（山东，济南）；长安科仪恒温水浴锅，购自于北京三二八科学仪器有限公司（中国，北京）；

UV-6100紫外可见分光光度计，购自于上海元析仪器有限公司（中国，上海）；FA2204电子分析天平（0.00001g），购自于上海十砚仪器设备有限公司（中国，上海）；BK-RE-1A型旋转蒸发仪，购自于山东博科（BIOBASE）生物产业有限公司（山东，青岛）；Waterse2695分析型高效液相色谱仪，购自于美国waters公司。

实验方法

人参不同炮制品中氨基酸成分的含量测定

供试品溶液的制备

精密称取上文中所制得的五种人参炮制品，并利用高速多功能粉碎机粉碎，测定五种炮制品的含水量差异，过40目筛，各取粉末2.0g，加入60mL甲醇，超声提取30min，离心、过滤，将所得残渣再加入60mL纯净水中，在40~55℃温度超声提取30min，重复两次，过滤，合并滤液，减压浓缩后，定容至25mL容量瓶中，备用。

供试品溶液的衍生

将氨基酸衍生试剂A和氨基酸衍生试剂B参照衍生说明书进行操作，先将衍生试剂A和B稀释5倍，然后各取稀释后的衍生试剂A和B100μL，置于试管中，再取上文中的供试品溶液160μL，振荡5~10s使其混合均匀，室温反应60min后，加入正己烷试剂400μL进行萃取，振荡5~10s后，混匀，反应5min后取下层200μL，加入800μL纯净水，混匀，过0.22μm的微孔滤膜，备用。

色谱条件

使用UltimateAminoAcid氨基酸分析专用柱（4.6mm×250mm，5μm）分析五种人参炮制品的氨基酸种类及其含量测定，其色谱条件参照供应商提供的氨基酸分析方法所述。流动相：流动相A为0.1mol/L醋酸钠溶液乙酸钠缓冲（pH=6.5）：乙腈（93:7），流动相B为乙腈：水（4:1）。检测条件为0~11min，0%~7%B；11~13.9min，7%~12%；13.9~14min，12%~15%B；14~29min，15%~34%B；29~32min，34%~70%B；32~35min，70%~100%B；35~42min，100%B；42~45min，100~0%B；45~60min，0%B；流速为1.0mL/min；检测波长254nm；柱温40℃；进样量20μL。

流动相A的配制：精密称取三水合醋酸钠13.6g，加入1000mL娃哈哈纯净水，超声搅拌充分溶解后加用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50，准确称量好醋酸钠水溶液930mL加色谱级乙腈70mL，混合均匀后，过0.22μm滤膜，作流动相A备用。

对照品溶液的配置及标准曲线的建立

精密称取一定重量的上述17种氨基酸，用纯净水溶解混合均匀，定容至5mL容量瓶中，配制成相应浓度的母液，然后按比例分别加入不同体积的纯净水，配制成一系列浓度的17种氨基酸的对照品溶液，按前文所述的衍生方法进行衍生，利用前文所述的色谱条件进行HPLC分析，根据17种氨基酸色谱峰面积，并以此为纵坐标（Y），以氨基酸混标的不同浓度为横坐标（X）分别绘制上述17种氨基酸的标准曲线。

精密度试验

选取前文项下所述的已知含量的供试品溶液，根据前文所述的色谱条件，精密吸取20μL，进行HPLC分析，重复进样6次，以17种氨基酸的峰面积为参考，记录6次HPLC分析的色谱峰面积变化，通过回归方程计算样品中氨基酸含量，并计算RSD值。

重复性试验

选取前文所述的已知含量的供试品溶液，根据前文所述的色谱条件，根据衍生方法进行衍生，进行HPLC分析，重复进样6次，以17种氨基酸的峰型和峰面积为依据，观察6次峰面积的变化，通过回归方程计算样品中氨基酸含量，并计算RSD值。

稳定性试验

选取前文所述的已知含量的供试品溶液，保证相同浓度的前提下，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h和48h八个时间段吸取相同体积，按照前文所述的色谱条件进行HPLC分析，以17种氨基酸的峰面积为依据，记录八个时间段的17种氨基酸的峰面积，计算RSD值。加样回收率试验

选取人参不同炮制品前文所述的已知含量的供试品溶液，分为6份，分别根据样品中各个氨基酸含量的20%加入17种氨基酸标品，按照前文所述的色谱条件，进行HPLC分析，计算供试品溶液中17种氨基酸的含量，根据回归方程计算加样回收率以及RSD值。

加样回收率（%）＝（C－A）/B×100%

其中，A表示为供试品所含被测成分的量，B为加入的相应对照品的量，C为实测值。

人参不同炮制品中多糖及还原糖类成分的含量测定

人参不同炮制品中多糖的提取

精密称取5种人参不同炮制品粉末（过80目筛）5.0g，根据1:20的料液比，加入蒸馏水，超声提取2次，60min（温度控制在70~80℃），重复两次，将两次提取液合并过滤，利用BK-RE-1A型旋转蒸发仪进行浓缩，随后加入无水乙醇（3~4倍），使浓缩液中乙醇总浓度高于80%，放置12h后离心，转速控制在4500r/min，5min，然后将离心所得沉淀分别用无水乙醇和丙酮等试剂进行洗涤得到粗多糖。

将上述制得的粗多糖经一定体积蒸馏水溶解后，利用氯仿:正丁醇=4:1的比例除去蛋白质，并按照体积比为1:10加入活性炭，与上清液混合搅拌（40~50min），温度维持在40~45℃下进行过滤，再加入一定体积的无水乙醇，同样使混合溶液乙醇浓度为80%左右，置于低温环境下静置24h，所得沉淀经乙醇和丙酮洗涤三次后，冷冻真空干燥制得精制多糖。

苯酚-硫酸法测定人参中多糖的含量

精密称取前文制得的五种人参炮制品的精制多糖各20mg，用蒸馏水溶解，定容至10mL容量瓶中，得到精制多糖供试品溶液（2.0mg/mL）；然后，准确称取D-葡萄糖对照品粉末50mg，经一定体积的蒸馏水进行最大限度的溶解，然后定容至5.0mL容量瓶中，制得浓度为10.0mg/mL的标准品储备液。

采用苯酚-浓硫酸法，按照先前所述的测定方法，吸取事先准备好的6%的苯酚溶液1.0mL于50mL三角瓶中，与上述溶液混合均匀，快速加入浓硫酸6.0mL，振荡摇匀，置温度为95℃以上的沸水浴中，10min后快速取出，在冷水环境下冷却3~5min。

随后按上述相同操作，准确称取1mL蒸馏水，在50mL三角瓶中加入1.0mL的苯酚溶液和6.0mL浓硫酸，振荡摇匀，从而制得空白对照品溶液用于调零。利用紫外-可见分光光度计，在485nm波长下记录五种人参炮制品的吸光度，根据葡萄糖标准曲线，计算其含量。

葡萄糖标准曲线的建立及方法学考察

精密吸取配制的标准品贮备液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL，加入一定量的蒸馏水，分别配成0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mg/mL的标准品使用液，分别吸取1.0mL，按照前文所述的苯酚浓硫酸法，在485nm波长下测定吸光度，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，建立葡萄糖标准曲线；

然后精密吸取标准品和供试品溶液2.0mL，在相同波长下测定吸光度，用于精密度试验，计算RSD值；在不同时间段（0、2、4、8、12和24h）称取标准品和供试品溶液，用于稳定性试验，计算RSD值；精密吸取供试品溶液1.0mL，各加入1.0mL不同浓度的标准品使用液，按照标准曲线制备方法测定吸光度，计算平均回收率和RSD值。

回收率=（加样试样测定值-试样测定值）/加标量×100%

人参中多糖溶液衍生

精密称取前文制得的五种人参炮制品多糖样品各20mg，溶于1.0mL蒸馏水中，精密吸取200μL，根据多糖衍生方法进行衍生，加入200μL0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，依达拉奉）溶液，再加入200μL0.3mol/L的NaOH溶液，混合均匀置于70℃水浴加热30min后，冷却至室温后加入200μL0.3mol/L的HCl溶液，再加入200μL的蒸馏水，振荡后，加入1.0mL氯仿萃取3次，取上层溶液过0.22μm滤膜，冷藏备用。

还原糖色谱条件

采用InertsilODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.2mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0~5min，18.5%A；5min~9min，21.0%A；9min~16min，26.5%A；16min~24min，26.5%~40.0%A；24min~33min，40.0%~60.5%A；35min~40min，60.5%~71.5%A）；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为250nm；进样量为20μL。

还原糖对照品溶液的制备及标准曲线的建立

精密称取鼠李糖（Rha）；葡萄糖醛酸（GlcA）；麦芽糖（Maltose）；葡萄糖（Glu）；半乳糖（Gal）；阿拉伯糖（Ara）各5.0mg，溶于一定量蒸馏水中，定容5.0mL容量瓶中，配制成1.0mg/mL的标准品溶液，分别吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别按比例加入一定量的蒸馏水，配制成0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL的系列还原糖对照品浓度。

精密度试验

选取前文所述的已知含量的多糖供试品溶液，根据前文所述的色谱条件，按衍生方法进行衍生后，精密吸取20μL，进行HPLC分析，重复进样6次，以6种还原糖的色谱峰的峰面积为依据，记录6次HPLC分析的对应峰面积变化情况，根据回归方程，计算多糖溶液中还原糖含量和RSD值。

重复性试验

选取已知含量的多糖供试品溶液，根据前文所述的色谱条件，根据衍生方法进行衍生后，进行HPLC分析，重复进样6次，以6种还原糖的峰型和峰面积为依据，观察6次峰面积的变化，根据回归方程，计算多糖溶液中还原糖含量和RSD值。

稳定性试验

选取前文所述的已知含量的多糖供试品溶液，保证相同浓度的前提下，分别间隔0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h等时间段吸取相同体积，按照前文所述的色谱条件，衍生后进行HPLC分析，以6种还原糖的峰面积为依据，记录上述8个时间段的相应6种还原糖的峰面积，根据回归方程，计算多糖溶液中还原糖含量和RSD值。

加样回收率试验

选取人参炮制品前文所述的已知含量的多糖供试品溶液，分为6份，分别按比例加入上述6种还原糖对照品，按照前文所述的色谱条件，衍生后进行HPLC分析，计算多糖供试品溶液6种还原糖的含量，根据回归方程计算加样回收率以及RSD值。

加样回收率（%）＝（C－A）/B×100%

其中，A表示为多糖供试品所含被测成分的量，B为加入的相应对照品的量，C为实测值。

参考文献：

[1] 李伟, 王莹, 刘伟. 人参、西洋参非药用部位开发与利用研究进展 [J]. 吉林农业大学学报, 2021,43(04): 383-392.

[2] 鹿扩建, 曹欢, 笔雪艳, 等. 基于人参炮制历史沿革探讨中国药典中红参炮制规范 [J]. 中国中医药信息杂志, 2020, 27(08): 27-29.

[3] Ziaei R, Ghavami A, Ghaedi E, et al. The efficacy of ginseng supplementation on plasma lipid concentration in adults: A systematic review and meta-analysis [J]. Complement Ther Med, 2020, 48: 102239.