摘要：TA克隆又叫T—载体克隆,是利用Taq聚合酶的特性将PCR产物高效克隆的方法。该实验经过7个过程:聚合酶链式反应(PCR)、PCR产物的鉴定和纯化、重组DNA的构建(连接)、大肠杆菌感受态细胞的制备、转化和筛选使得大肠杆菌获得新的遗传性状。结果表明:经过PCR和纯化反应获得了一定数量且长度约为400bp的片段,其浓度达到51.5 ng/u L。经过蓝白斑筛选获得了可能具有外源DNA片段插入的白色细菌菌落。

　　关键词：pMD18-T,蓝白斑筛选,PCR,电泳,纯化

　　1 前言

　　1.1 聚合酶链式反应

　　聚合酶链式反应(PCR)是利用DNA模板序列的两端互补的一对寡聚核甘酸引物来扩增一段DNA序列。经过三步反应,即变性,引物退火和聚合的循环来相对延伸,经过n次循环后目标分子会扩增至2 n。

　　1.2PCR 产物的鉴定和纯化

　　扩增后的PCR产物的量和片段长度会直接影响到后续的连接反应,因此需要将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,来测定并分离不同大小的DNA片段并根据显色的结果判断产物量的多少。经过PCR成功扩增后,其反应体系中还含有游离的d NTP,金属离子和酶。本实验使用Bio Flux柱离心式PCR产物纯化试剂盒,快速、有效地纯化PCR反应产物中的DNA片段。

　　1.3 重组 DNA 的构建(连接)

　　TA克隆技术(TA cloning)利用Taq聚合酶具有末端转移酶(Td T)活性,但却不具有3'-5' 端外切酶校准活性的特点,可在PCR产物的3' 端加上一个非模板依赖碱基“A”。p MD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体,它是由p UC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个Eco R V位点,然后用Eco RV进行酶切使质粒线性化,并在它的3' 端添加“T”构建而成。因其3' 端带有一个突出的“T”尾,能高效地与带“A”尾的PCR产物连接,极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。

　　1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

　　人们发现用含钙离子的的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源的DNA,这一过程称为转化。被钙离子预处理过的细胞称为感受态细胞。

　　1.5 蓝白斑筛选

　　转化细胞培养好后,首先需要一种筛选含有重组质粒的方法。若将转化的细胞涂布于含氨苄青霉素的平板上,则只有那些含有被转化的质粒,表达β- 内酰胺酶的细胞才能生存并繁殖。但却无法确定哪个克隆中含有带有目的基因的片段的重组质粒。蓝白斑筛选可在同一转化平板上完成筛选。它利用一种蓝色化合物的形成为指示剂。当大肠杆菌表达lac阻抑物,则载体上的lac Z基因就由IPTG诱导表达,表面形成的酶就可以利用底物X-gal形成一种蓝色化合物。重组质粒的lac Z基因因插入失活而不能形成蓝色菌落。白色菌落未表达β- 半乳糖苷酶,因而可能含有插入的目的基因片段,需要进一步的实验证明。

　　2 正文

　　2.1 实验材料

　　CRYSTAL IS-RDD3恒温振荡器、Xiang Yi H-1650台式高速离心机、UVP凝胶成像系统、Biometra Thermocycler PCR仪、EPS 301电泳仪、Nano Drop 2000超微量分光光度计、Bio Flux柱离心式PCR产物纯化试剂盒

　　2.2 方法步骤

　　2.2.1PCR扩增

　　在4个0.2m LEP管中按顺序加入以下试剂:36.5 u Ldd H2O、5 u L10×PCR缓冲液、4 u Ld NTP、2 u L3’AOX下游引物、1u L5’AOX上游引物、1 u LDNA模板、0.5 u LTaq酶。上述试剂加好后盖好盖子,手弹均匀后,短暂离心后,放入PCP反应仪,设好如下程序即可:95℃5min变性;94℃30s变性;57℃30s退火;72℃30s延伸,循环31次后,72℃7min延伸,4℃终止。

　　2.2.2PCR 产物的鉴定

　　(1)胶的制备(1% 琼脂糖)

　　称取0.2g琼脂糖和20m L 1×TAE缓冲液于锥形瓶中,用称量纸包好瓶口,置于微波炉中加热至完全融化(重复3次)。将融化好的琼脂糖冷却至50-60℃(手能勉强拿住),把梳子预先插入制胶的模具中,缓缓倒入液体,形成一层均匀的胶面,待胶完全凝固后,小心的拔出梳子,并取出胶块放入电泳槽的缓冲液中。

　　(2)电泳

　　从4个EP管中各取5u L样品,分别与1u L溴酚蓝染料混匀,加入加样孔中。最后加入加标准DNA marker。接通电源,按照需要调节电压。电泳结束后将凝胶浸入溴化乙锭(EB)中染色5 min。观察4管中的PCR反应是否成功。若PCR反应成功,则观察PCR产物的量以及片段的大小。

　　2.2.3 PCR 产物的纯化

　　取1个0.2ml的EP管按1:1的比例加 入如下试 剂: 如180u L PCR产物 + 180u L Binding Buffer

　　将混匀的上述溶液各自转移至离心柱中,室温静置1min后,进行12000r/min离心1 min, 弃去下层废液;往柱子中加入750ul的wash buffer, 12000 r/min离心1min后 , 弃去废液;往柱子中加入500ul的wash buffer, 12000 r/min离心1min后 , 弃去废液;将柱子12000 r/min离心1min后,转移到1.5m L的EP管中,并加入25u L的Elution Buffer,室温静置1min ,最后12000 r/min离心1min ,弃去柱子,保存离心管中的片段,至此PCR产物纯化完成。

　　2.2.4 PCR 产物浓度的测定

　　取1u L的PCR纯化产物用Nano Drop 2000超微量分光光度计进行其浓度和OD值的测定。将测好的浓度转化为相应的拷贝数公式:Pmol of ds DNA=ug(of ds DNA)*1515/Nbp

　　2.2.5 连接

　　按顺序在0.2u L的管中建立如下10u L的连接反应体系:5uL SolutionⅠ、1.6 uL PCR产物、2.4 uL ddH 2O、1 u LPMD18-T载体。因为PCR产物的拷贝数应是PMD18-T载体拷贝数的10倍,才能保证连接效率。在琼脂糖凝胶电泳的结果中,已知PCR产物的大小为400bp,且测得ds DNA浓度51.5 ng/u L带入公式Pmolof ds DNA=ug(of ds DNA)*1515/Nbp,则得到PCR需加入1.6ul。

　　2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

　　将1m L细菌培养物放在的无菌EP管中,冰浴15分钟后放在4℃的离心机中8000r/min离心1分钟,倒掉上清,取1m L预冷的氯化钙制成单细胞悬液(吹吸均匀),放在4℃的离心机中8000r/min离心1分钟,倒掉上清,再取1m L预冷的氯化钙制成单细胞悬液(吹吸均匀),冰浴30分钟后,放在4℃的离心机中8000r/min离心1分钟,倒掉上清,加入100u L预冷的氯化钙并吹吸均匀,冰上放置即为感受态细胞。

　　2.2.7 转化

　　无菌条件下吸取感受态细胞悬液100u L(可将2管混匀)放在1.5m L的无菌EP管中,立即放在冰上。

　　将10u L连接体系中的液体全部吸入上述EP管,并混匀,冰上放置30分钟。在42℃恒温水浴锅中热击90~120秒。热击后迅速置于冰上3~5分钟。向管中加入1m L的LB液体培养基,混匀。在37℃摇床上振荡培养1个小时。

　　2.2.8 蓝白斑筛选

　　将摇好的菌液进行短暂离心,吸掉上清液750u L,余下的直接吹吸均匀制成单细胞悬液。全部涂在含IPTG和X-gal以及抗生素的培养基上,37℃倒置培养16~24小时。