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本课题中采用的ＲＮＡ底物为仅包含ＧＧＡＣＵ五个核苷酸的超短链ＲＮＡ，由 于分子太小需要对常规的纯化过程作出相应调整

标准的固相合成操作与脱保护 过程与前文描述的一致

在获得ＲＮＡ沉淀之后同样用双蒸水溶解，先经过脱盐 柱纯化，由于ＲＮＡ无法浓缩，因此将脱盐柱收集液全部流经Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ离子交 换柱，保证ＲＮＡ分子全部与填料相结合

ＧＧＡＣＵＲＮＡ分子于３０ｓ／ｃｍ电导左 右出峰，在洗脱时需要将梯度放缓，２５％－３５％的ＱＢｂｕｆｆｅｒ，洗脱体积１５０ｍＬ， 保证ＲＮＡ分子与短链副产物分离

经离子交换柱纯化的样品体积较大，经冻干 减少样品体积至１０ｍＬ以下之后再以双蒸水为流动相使用脱盐柱出去溶液中的 无机盐

最终流出液再分装为５ｍＬ每管进行冻干，获得纯ＲＮＡ干粉样品，在 进行实验之前用实验ｂｕｆｆｅｒ充分溶解，再经２６０ｎｍ的吸收测定浓度

样品无法 使用凝胶电泳鉴定，因此使用核磁共振采集天然丰度下的ＨＳＱＣ来判断样品的

纯度与准确性

最终选取的用于ｍ６Ａ结构研宂的ＲＮＡ序列均由固相合成获得，合成ｍ６Ａ 修饰的ＲＮＡ样品时采用ｍ６Ａ修饰的亚磷酰胺单体即可，样品制备、退火方式及 浓度测定与前文相同，最终ｂｕｆｆｅｒ与核磁共振采用ｂｕｆｆｅｒ相同

超短链ＲＮＡ的体外转录

对于核磁共振需要的同位素标记的ＧＧＡＣＵＲＮＡ需要用体外转录的方法来 获得体外转录采用前文提到的常规操作来进行，并且扩大转录体系采用预实验 中４号实验条件

ＲＮＡ分子经Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ纯化，并于３２ｓ／ｃｍ电导左右出峰， 因为转录样品的５’端为磷酸基团，而固相合成样品的５’端为羟基，因此对于超 短链ＲＮＡ分子来说转录制得的样品要比固相合成样品与离子交换柱有略强的亲 和力

同样地，在洗脱时需要将梯度放缓，２５％－３５°／〇的ＱＢｂｕｆｆｅｒ，洗脱体积１５０ ｍＬ

由最终洗脱结果发现，一般会有两个相邻的洗脱峰出现，而且可以完全分 离，经核磁鉴定，靠前的洗脱峰对应的样品少了最后一个碱基Ｕ，靠后的洗脱峰 才是完整的ＧＧＡＣＵ样品

样品经冻干之后经过脱盐柱纯化，再冻干获得ＲＮＡ 干粉

相关ＮＭＲ实验

对于ＧＧＡＣＵＲＮＡ底物的归属是通过ＨＳＱＣ谱图的比较得到的

由于 ＧＧＡＣＵ没有碱基配对，因此并没有ｉｍｉｎｏｐｒｏｔｏｎｓ的信号，我们使用１Ｈ－１３ＣＨＳＱＣ 谱图来对ＲＮＡ分子中所有Ｃ－Ｈ进行归属

实验在配备了超低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ ＭＨｚ或者８５０ＭＨｚ核磁共振谱仪上进行，实验温度为２８８Ｋ，并且将ＲＮＡ用 １００％氘水配置的实验ｂｕｆｆｅｒ溶解，实验浓度在５００左右

在进行ＲＮＡ的核 磁滴定时，以１００ｐＭ的ＲＮＡ作为底物，然后按照０、５０、１００、１５０、２００ｐＭ 的终浓度逐步滴入非同位素标记的野生型ＺＦＤ蛋白，ＺＦＤ蛋白保持在较高的浓 度以保证每次加入的蛋白体积很小

最后通过ＮＭＲＰｉｐｅ软件对每张ＨＳＱＣ谱图 的信号峰进行归属，就可以获得ＲＮＡ分子每个Ｃ－Ｈ的信号随着ＺＦＤ蛋白浓度 增加产生的化学位移变化

通过公式Ａ３＝［０．５ｘＡ５Ｈ２＋０．１ｘＡＳＣ２）ｆ５计算每个信号峰的平均化学位移扰动（ｃｈｅｍｉｃａｌｓｈｉｆｔｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ，ＣＳＰｓ），其中Ａ８Ｈ和Ａ５Ｃ分 别是氢维和碳维的化学位移变化值

最后在软件ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ９．０上通过非线性拟 合获得ＲＮＡ与ＺＦＤ的Ｋｄ值

ＺＦＤ的１Ｈ－１５Ｎ－ＨＳＱＣ配备了超低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振谱仪上 进行，实验温度２８８Ｋ，在实验ｂｕｆｆｅｒ中加入１０％氘水

以１００ｐＭ的１５Ｎ标记 ＺＦＤ作为底物，滴定时按照０、２０、５０、１００、１５０、２００的终浓度逐步加入 非同位素标记的ＧＧＡＣＵＲＮＡ底物

通过ＮＭＲＰｉｐｅ软件按照已有的ＺＦＤ蛋白 归属对每张ＨＳＱＣ谱图的信号峰进行指认，就可以获得ＺＦＤ蛋白每个残基的 ｉＨＪＮ信号随着ＲＮＡ分子浓度增加产生的化学位移变化

然后通过公式 Ａ５＝ｌ〇．５ｘＡ５Ｈ２＋０．１ｘＡＳＮ２；）］ａ５计算每个信号峰的平均化学位移扰动，然后以同样 的方式拟合获得ＺＦＤ与ＲＮＡ的Ｋｄ值，通过蛋白质滴定ＲＮＡ与ＲＮＡ滴定蛋白 共同确认ＺＦＤ与ＲＮＡ底物的解离常数

ＺＦＤ的１Ｈ－１３Ｃ－ＨＳＱＣ滴定实验与之相 仿，除了实验ｂｕｆｆｅｒ采用纯氖水配置，实验样品为１３Ｃ－１５Ｎ同位素标记的ＺＦＤ与 非同位素标记的ＲＮＡ

ＮＯＥ实验

本实验选取的ＲＮＡ分子过小，我们通过ｔｒａｎｓｆｅｒＮＯＥ的方法来检测结合了 ＺＦＤ之后ＲＮＡ的分子内ＮＯＥ，以获得复合体中ＲＮＡ自身的ＮＯＥ结构约束

实验ｂｕｆｆｅｒ用纯氖水配置，使用终浓度１ｍＭ的非同位素标记的ＲＮＡ作为对照， 实验温度２８８Ｋ，ｍｉｘｉｎｇｔｉｍｅ设置为２００ｍｓ，ＮＯＥ实验在配备了超低温探头的 Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振谱仪上进行

在ＲＮＡ对照组的基础上逐步按照５０、１００、 ２００ｐＭ的终浓度加入野生型非标记的ＺＦＤ蛋白，然后通过对比交叉峰信号可以 获得ＧＧＡＣＵＲＮＡ在结合了ＺＦＤ蛋白之后的分子内ＮＯＥ

除此之外我们还通过ＮＯＥ验证与ＲＮＡ底物结合之后ＺＦＤ本身的结构有无 显著变化

使用终浓度２００的非同位素标记的ＺＦＤ作为对照，实验ｂｕｆｆｅｒ 中加入１０°／

氘水，实验温度２８８Ｋ，实验于北京大学Ｂｒｕｋｅｒ９５０ＭＨｚ核磁共振 谱仪上完成

在ＺＦＤ蛋白对照组中加入三倍于蛋白浓度的ＲＮＡ，以完全相同的 条件采集ＮＯＥ信号，通过ＮＯＥ谱图中交叉峰的对比，观察ＺＦＤ结构的变化

ＰＲＥ实验

实验在配备了超低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振谱仪上进行

实验样 品为ＥＤＴＡ－Ｍｎ２＋顺磁探针标记且非同位素标记的ＺＦＤ蛋白，１３Ｃ－１５Ｎ同位素标记 的ＲＮＡ底物

实验温度为２８８Ｋ（与滴定实验检测Ｋｄ时的温度保持一致以方便 计算复合物比例），实验ｂｕｆｆｅｒ由纯氘水配置，ＰＲＥ实验采用弛豫衰减过程中的 两个点来拟合弛豫速率，两点间的时间间隔为３ｍｓ

最初的实验探索中采用蛋 白：ＲＮＡ为３：１（６００：２００ｐＭ）的比例，但是实验结果显示连接顺磁中心的ＺＦＤ 浓度过高将ＲＮＡ的信号基本完全衰减，之后的改进实验中将两者浓度比例反过 来，即ＲＮＡ：蛋白为１：３以保证ＲＮＡ信号不会被完全衰减

弛豫速率的计算在第 二章节己作介绍

ＲＤＣ实验

在本课题中ＲＤＣ实验包括单独ＺＦＤ蛋白的ＲＤＣ测量、单独ＲＮＡ的ＲＤＣ 测量、ＲＮＡ＋ＺＦＤ中ＺＦＤ的ＲＤＣ测量以及ＲＮＡ＋ＺＦＤ中ＲＮＡ的ＲＤＣ测量

实 验在配备了超低温探头的Ｂｒｎｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振谱仪上进行

对于单独的ＺＦＤ 蛋白的ＲＤＣ实验，实验样品为终浓度为２００ｐＭ的１５Ｎ同位素标记的野生型ＺＦＤ， 实验温度为２８８Ｋ

我们以未加介质的溶液状态下的ＺＦＤ的Ｎ－Ｈ键耦合值作为 对照，并在相同条件下采集加入了液晶介质ｐｆｌ（ＡＳＬＡＢｉｏｔｅｃｈ，产品目录号： Ｐ－１００－ＲＮＡ）的Ｎ－Ｈ键耦合值，两者相减获得单独的ＺＦＤ的ＲＤＣ值

与第三章 实验方法部分介绍的相似，在ＲＤＣ实验之前以氘核的裂分值作为指示逐步增加 ｐｆｌ介质的浓度，最终加入的ｐｆｌ介质的终浓度为９ｍｇ／ｍＬ

同样地，以２００ｐＭ 的１５Ｎ同位素标记的野生型ＺＦＤ加上６００的非标记的ＧＧＡＣＵＲＮＡ底物作 为对照，然后加入介质ｐｆｌ以相同的条件获得在有液晶介质的情况下ＺＦＤ的Ｎ－Ｈ 键耦合值，两者相减获得在ＺＦＤ与ＲＮＡ复合物中ＺＦＤ部分的Ｎ－Ｈ键ＲＤＣ值

对于单独ＲＮＡ的ＲＤＣ测量方法与第三章中测量ｐｒｅＱｉ核糖开关ＲＤＣ的方 法一致，针对ＲＮＡ特征的Ｃ－Ｈ的化学位移分布分三部分对ＲＮＡ的Ｃ－Ｈ键ＲＤＣ 值进行测量

实验样品为终浓度为２００ｎＭ的１３Ｃ－１５Ｎ同位素标记的ＧＧＡＣＵＲＮＡ 溶液，实验温度为２８８Ｋ，，最终加入的ｐｆｌ介质的终浓度为９ｍｇ／ｍＬ

同样地， 以２００ｐＭ的１３Ｃ－１５Ｎ同位素标记的ＧＧＡＣＵＲＮＡ加上６００ｐＭ的非标记的野生型ＺＦＤ蛋白作为对照，然后加入介质ｐｆｌ以相同的条件采集数据，最后两者相 减获得在ＺＦＤ与ＲＮＡ复合物中ＲＮＡ部分的Ｃ－Ｈ键ＲＤＣ值