前言

分子性别已被证明在生物学中具有广泛的应用，包括保护生物学，古遗传学和动物考古学。对于像现代大象这样的濒危物种，监测种群内部和种群之间的性别分布的能力对于生态调查和保护计划至关重要。

例如，它揭示了世界不同地区自然种群中性别比例的人为偏见，这是由于对大型象牙（即雄性）大象的选择性偷猎。在发生人象冲突的地区，通过整合雄性和雌性之间作物摄食行为的已知差异，了解袭击个体的性别可能有助于缓解紧张局势。

在对大象野生种群的遗传调查过程中，最典型的采样材料长期以来一直是非侵入性粪便样本，此类材料的收集通常在没有实际看到动物的情况下进行，因此其个体性别仍然未知。由于粪便团的大小与动物的实际大小高度相关，因此由于大象中重要的性别二态性，它可以识别出最大的粪便属于雄性标本.然而，对于绝大多数粪便来说，个体的性别仍然无法辨别。

摘要

大象遗传学中使用的另一种典型材料是查获的象牙，可以采用相同的理由来确定性别，因此具有相同的一般限制。因此，人们寻求分子方法来快速有效地评估大象的性别。然而，这些样本的性质在其遗传分析中带来了另一个困难。根据收集的粪便的新鲜度，样品中的大象DNA含量在数量和降解水平上可能会有很大差异。

经过五天的沉积，线粒体或核DNA的靶向PCR扩增已被证明是困难甚至不可能的。尽管象牙的高矿物质含量使其能够在最佳条件下保留一些DNA长达数千年，其在活细胞中的低原始含量减少了可回收的DNA总量.因此，从象牙或粪便中提取的DNA通常表现出死后降解的典型特征，特别是高水平的碎片化。这些特征使得从这些样品中确定性别的分子变得不平凡。

新型锌指TaqMan检测的设计

为了确定大象分类群中锌指基因的序列保守水平，我们使用Geneious R9对齐了等位基因和每个属的已知ZFX / Y区域。对于亚洲象，我们使用了之前发表的Sanger序列。对于猛犸象和非洲象，由于缺乏沉积在序列数据库中的实际锌指序列，我们通过从已知的雄性标本中获取已发表的全基因组NGS读数来恢复相应的序列。

这种对齐表明，在亚洲象亚科的规模上，区分亚洲象ZFX和ZFY等位基因的特征完全保守。该地区的低覆盖率数据（4X）也可用于美洲乳齿象，一种已灭绝的长鼻动物物种，与大象类群的亲戚相当遥远：它们最近的共同祖先可以追溯到25-30 Mya（Elephantimorpha分支）与大象序列的比较强烈表明，这些等位基因特征在长鼻动物中是古老的。相反，当添加到我们的比较中时，现代人类重叠的ZFX / Y序列显示出与大象动物的几个固定的不同位置。

体外敏感性实验

为了解决我们测定的灵敏度，我们首先生成了性别特异性定量标准品：我们稀释了雄性猛犸象DNA提取物，直到使用该稀释液作为模板的实时荧光定量PCR反应只能扩增一种或另一种性别特异性等位基因（或根本没有产物）。我们合并了三个反应，其中一个微管中仅检测到X等位基因，另一个微管中另外三个Y阳性反应。

使用矿琅PCR纯化试剂盒（Qiagen，Venlo，NL）纯化每个池，并分别浓缩在10μlEBT缓冲液（补充有0.05%吐温-20的Qiagen EB缓冲液）中。我们使用Qubit高灵敏度检测试剂盒（Invitrogen，Waltham，MA）定量了每种性别特异性标准品，并制备了10倍稀释系列，范围从<>10副本减少到 10 份−1每μl拷贝。标准系列以冷冻等分试样储存，仅在使用前解冻。

我们从两个维度分析了测定的灵敏度：（I）绝对拷贝数PCR扩增的灵敏度和（II）X和Y特异性等位基因诊断的相对灵敏度。我们首先使用SYBR Green I方法测试了测定的一般灵敏度，使用1X Sso-Advanced Supermix（Bio-Rad，Ipswich，MA）和每个等位基因的标准系列（105低至 10−1每个），在低端使用6个标准品重复（2×100和 2 × 10−1)。

然后，我们通过TaqMan反应评估了每个MGB探针的相互灵敏度，使用范围从105低至 100每个，最新的三个重复。对于基于探针的PCR反应，我们使用了专用的TaqMan快速高级预混液（应用生物系统，加利福尼亚州福斯特城），其中包含dUTP和尿酰-N-糖基化酶（UNG）预处理步骤，以避免残留PCR产物的PCR污染。

定量PCR优化和基因型分析

我们比较了TaqMan反应与引物浓度在400至900nM之间，最终探针浓度在200至600nM之间以及退火/延伸温度梯度（55-65°C）的各种组合的行为。无论试剂浓度如何，在60.5°C左右都能获得最佳灵敏度：当选择较低或较高的温度时，标准品的Cq分别延迟了0.8或1.2个循环。

平衡的MGB探针浓度系统地产生了FAM探针比VIC探针更高的响应（高达150%），并且有时会在VIC检测范围内引起浅串扰信号伪影。实施不均匀的探针浓度 - 将VIC增加三分之一，将FAM降低同样多 - 解决了这两个问题。因此，我们对所有后续实验采用了以下条件：最终反应体积为15μl，1X TaqMan超级混合物，每个引物800 nM，Y-FAM探针375 nM，X-VIC探针525 nM和1-2μlDNA提取物。

我们在CFX-96实时热循环仪（Bio-Rad，伊普斯威奇，马萨诸塞州）上使用以下两步条件进行了所有PCR反应：在2°C下首次变性2′后，我们进行了95次40.95°C0秒和10.60°C5秒的循环。我们使用CFX-Manager软件v35.3（Bio-Rad，伊普斯威奇，马萨诸塞州）使用以下一组参数对qPCR输出进行等位基因区分：基线减去曲线拟合，定量周期（Cq）通过设置为平均平台荧光的1%确定（以重新缩放荧光单位，RFU测量），最后一个PCR循环的等位基因调用。

特异性分析

我们通过直接qPCR尝试对各种浓度的对照人类基因组DNA（Thermofisher，猫号4312660）研究了我们针对人类污染物的测定的特异性水平：每次反应1，5和25 ng。我们通过对测定进行计算机评估来补充该分析：我们使用BLASTn32分析GenBank中的“nr”收集数据库，并确定哪些分类群与我们的至少一个引物共享序列身份。在这些热门作品中，我们专注于大象科动物（现代和灭绝）的假定同源分类群，为此我们对齐了可用的ZFX / Y片段。

尽管使用 MGB-TaqMan 方法进行非特异性检测的风险极低31，我们选择在案例研究实验中监测PCR设计的特异性。我们准备了两个池 - 每个案例研究一个 - 来自整个重复系列中实际标本的所有阳性PCR反应。我们将这些池转换为双索引 Illumina 库中并对每个进行浅测序（配对端2 * 75 bp）。

大象粪便提取物案例研究

我们于 2016 年 2019 月至 1970 年 70 月在基巴莱国家公园（乌干达西南部）附近的塞比托利地区对野生大象进行了粪便采样。这个森林地区的野生动物位于保护区的北部，由塞比托利黑猩猩项目/类人猿保护项目和国家自然历史博物馆（MNHN，巴黎，法国）进行研究。Sebitoli森林在14年代进行商业砍伐，现在由<>%的再生森林和仅<>%的原始森林组成在基巴莱附近地区，人口密度很高（约300居民/公里2)。

他们种植单一栽培，如茶田、桉树和香蕉种植园，以及玉米等作物，吸引大象和灵长类动物离开森林。这项调查是一个项目的一部分，该项目旨在减轻保护区边缘的人与野生动物冲突，该项目位于MNHN，乌干达野生动物管理局和乌干达马凯雷雷大学之间的谅解备忘录SJ 445-12以及西澳大学和GACP之间的谅解备忘录框架内。

检测的灵敏度

对于基于SYBR Green定量的标准系列分析，当我们使用至少两个模板分子拷贝时，所有PCR反应均为阳性。相反，在使用0.2模板拷贝的六个反应中，只有一个反应产生了正扩增。当通过TaqMan定量分别评估ZFX / Y等位基因时，所有反应均为阳性，每个等位基因的一个拷贝。

但在该浓度下进行的三个重复中，并未检测到两个等位基因：一个重复仅检测到X等位基因，一个仅检测到Y等位基因，最后一个重复检测到两者。对独立拍摄的每个性别特异性等位基因的标准曲线的检查显示探针之间的动力学非常相似：两者的测量效率约为98%，在整个反应过程中X-VIC响应略有延迟约半个周期。对于每个等位基因，标准曲线显示线性定量响应（一旦对数变换）从 105低至一个副本，相关因子 R2 > 0.997。

结论

出于法医原因或了解种群人口统计和遗传结构，从大象样本（野外粪便或查获的象牙）中确定大象的性别非常重要。由于这些样品中DNA的降解，过去二十年开发的分子性别方法通常显示出有限的效率，特别是在灵敏度和特异性方面。

这些限制也阻止了它们与大象或猛犸象的古代DNA样本一起使用。在这里，我们提出了一种新的TaqMan-MGB qPCR测定来解决这些困难。我们专门设计了它，以便对所有大象分类群（大象和猛犸象）的高度降解样本进行遗传性别表征。

体外实验表明具有高水平的灵敏度和低污染风险。我们在两个实际案例研究中应用了该测定，其中它始终如一地先验地恢复已知性别标本的正确基因型。在对非洲大象的现代保护调查的背景下，它允许确定超过99%的粪便样本的性别。在对猛犸象的古遗传学分析中，它对三个PCR重复中超过65%的标本产生了一个强有力的性别假设。这种简单、快速且具有成本效益的程序使其易于适用于大样本量。

参考文献

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