介绍

采伐等问题，导致产量损失巨大，粮食质量下降，难以收获。

小麦镰刀菌是玉米茎腐病最常见的病原体，在产生大穗的高产杂交种中更常见。

禾本科小麦孢子可以通过污染土壤幼苗的根进入玉米植株，也可以通过机械损伤部位直接进入宿主茎。

侵染可扩散到植株的上节间，削弱茎秆，导致整个植株脱落超过。

该病原体还分泌霉菌毒素，如脱氧羊草烯醇和玉米丙烯酮，对人类和牲畜的健康构成威胁。

由于病原体通过土壤传播和侵染植物，杀菌剂对控制玉米茎腐病无效。

使用抗性基因将是控制该疾病最经济和最有效的策略。

一些抗茎腐病的数量性状位点具有代表性已报道，但只有2例已克隆并鉴定出，包含CCT域 ZmCCT基因被鉴定为茎秆相关基因与qRfg1位点相关的腐烂抗性。

玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因编码鉴定了一种质体基质定位的生长素调节蛋白是茎腐抗性基因，所在地玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因蛋白被发现可以调节平衡玉米生长与抗茎腐病抗性之间的关系。

三种混杂的细胞色素0和一种新的类固醇还原酶的氧化和随后的去饱和间接主要产生酮相关抗生素，是茎所必需的防霉。

另一项研究表明，ZmHIR3增加通过控制细胞死亡来抵抗茎秆腐病。

然而，阻力茎腐病被定量遗传和控制具有加性效应的基因。

没有特定的基因授予迄今为止，已确定了对这种疾病的免疫力。

材料和方法

2.1 植物材料和小麦植株的接种

利用自交系研究了玉米对小麦小麦侵染的变化。

玉米植株在正常条件下生长，直至10叶期。

在液体绿豆肉汤中摇晃孵育5天，产生禾本科菌孢子。

人工接种时，使用无菌微管尖端在土线上方第三节间的茎上打一个孔，注射孢子悬液。

模拟接种采用无菌水代替孢子悬浮液。

创面用无菌纱布覆盖，使植株保持在正常生长条件下。

在每个测试时间点，将接种的节间进行切割和纵向分裂，以进行症状分析。

处理3个重复，收集的茎在-80C下进行分析。

2.2 蛋白质提取、消化和串联质谱标记标记

用秸秆在接种后8天进行蛋白质组学分析。

各组提取总蛋白。用水溶性复合物蛋白测定试剂测定蛋白浓度。

用胰蛋白酶消化后，按照制造商的说明，用6倍的TMT试剂标记多肽。

标记为样品汇集并真空干燥。

2.3 肽分离和液相色谱-串联质谱

使用净化系统通过强阳离子交换色谱来分离多肽，质谱/质谱分析是在萃取质谱仪和Easy-nLC仪器上进行的。

2.4 蛋白质鉴定和数据分析

使用蛋白质组发现者将原始数据文件转化为MGF格式，对于蛋白质的鉴定和定量，我们使用了植物数据库。

应用以下搜索参数：肽质量耐受性：±20lLL1，MS/MS耐受： 0.1 Da，最大缺失切割：2。

用胰蛋白酶作为裂解酶。

可变修饰分别为氧化修饰和串联质谱标签6通路试剂 ，固定修饰分别为氨基甲基、串联质谱标签6通路试剂。

积分窗口公差设置电荷态设为+2~+3，以错误发现率0.01作为多肽和蛋白质的过滤参数。

小麦和模拟接种样品之间差异积累的蛋白符合以下标准：倍数变化> 1.5、FDR < 0.05和独特肽2.原始的基于质谱的蛋白质组学数据已存储在蛋白质交换联盟的中。

使用程序，用基因本体论术语对差异积累的蛋白质进行了功能注释。

利用京都基因和基因组百科全书数据库的工具，鉴定了富含差异积累蛋白的代谢途径。

2.5 定量逆转录聚合酶链反应分析

用总核糖核酸试剂盒从收集的茎中提取总核糖核酸。

采用橡皮擦两步引物脚本试剂盒合成cDNA。

分析了3个生物重复。

定量逆转录聚合酶链反应分析采用实时检测系统进行。以18S r核糖核酸为标准，采用2DDCT法计算相对表达量。

2.6 亚细胞定位

扩增抗氧化蛋白全长编码序列，并在花椰菜花菜花叶病毒启动子控制下克隆到载体中，获得抗氧化蛋白-GFP。

为了研究抗氧化蛋白的亚细胞定位，我们以空的载体作为对照。

将这些载体独立转染到玉米原生质体中，如所述。

原生质体在25C黑暗孵育18 h，在共聚焦显微镜下观察GFP信号并拍照。

2.7 玉米转化与植物特性分析

在启动子和终止子的控制下，扩增抗氧化蛋白的长度编码序列，克隆到载体中。

利用农杆菌根癌菌介导的转化，该载体使用描述的方案引入玉米杂交。

采用基因特异性引物进行检测，鉴定出40株T0阳性植株。

将植株自花授粉产生T4转基因代。

将T4转基因阳性和阴性植株以及亲本按上述方法接种小麦小麦孢子。

分别在公元8、10、14、16、18、20和28日采集秸秆。

使用软件测量棕色感染区域的纵向长度为病变大小。处理3个重复。

结果

3.1 玉米对小麦侵染后差异积累蛋白的鉴定

采用定量蛋白质组学分析方法，鉴定了玉米中与小麦抗性相关的蛋白。

将玉米自交系接种小麦小麦孢子悬液或模拟溶液。

在8 DAI时，接种小麦的玉米植株表现出严重的茎腐病症状，而模拟接种的玉米植株则保持健康。

得到24738个光谱，对应6814个蛋白，其中差异积累763个，上升436个，下降327个。

3.2 差异积累蛋白的功能分类和生物学途径

在差异积累蛋白中最富集的途径是代谢途径、次生代谢物的生物合成和碳代谢。

在差异积累蛋白中富集的氧化石墨烯亚类为单生物体代谢过程和氧化还原过程。

因此，广泛的细胞过程可能在玉米对小麦赤霉病感染的反应中发挥作用。

在分子功能类中，差异积累蛋白中最丰富的亚类是氧化还原酶活性，表明ROS代谢在茎腐抗性中发挥作用。

在这些向上积累的蛋白中，我们选择了参与抗氧化活性的抗氧化蛋白进行进一步研究。

3.3 抗氧化蛋白的表达模式及亚细胞定位

我们通过定量逆转录聚合酶链反应鉴定了抗氧化蛋白的表达模式。

我们在多个玉米组织中检测到了抗氧化蛋白的转录本，包括根、茎、叶、耳和生殖组织。

我们还检测了接种小麦感染后Lx9801中抗氧化蛋白的表达，发现小麦感染后抗氧化蛋白的表达显著上调。

结果显示，小麦感染后抗氧化蛋白蛋白水平积累升高。

我们还检测了抗氧化蛋白在其他玉米自交系中的表达量，所有这些株系中抗氧化蛋白的表达均在小麦小麦感染中强烈上调，其模式与Lx9801中观察到的相似。

这些结果表明，抗氧化蛋白可能在玉米对小麦小麦侵染的应答中发挥作用。

3.4 过表达抗氧化蛋白增加了玉米对小麦茎腐病的抗性

由于抗氧化蛋白的基因转录和蛋白积累均在小麦小麦侵染中被显著诱导，我们进一步研究了增加抗氧化蛋白的表达是否能增加玉米对茎腐病的抗性。

为了验证这种可能性，我们获得了过表达抗氧化蛋白的转基因玉米植株，定量逆转录聚合酶链反应和分析结果证实，T4转基因阳性株系中抗氧化蛋白的转录本和蛋白积累水平高于阴性株系。

三节间，记录茎腐症状。

在8~28DAI之间，在转基因阳性和阴性株系中均检测到感染引起的棕色病变。

然而，抗氧化蛋白转基因阳性株系的病变明显小于阴性株系。

由于转基因植株是从Hi-II株系发展而来的，我们还研究了亲本对禾草芽孢镰刀菌感染的表型。

结果表明，均对玉米茎腐病敏感。

表明转基因阳性株系的抗性是由于抗氧化蛋白的过表达所致。

因此，过表达抗氧化蛋白促进了对小麦小麦侵染引起的玉米秆腐病的抗性。

结论

比较蛋白质组学分析是一种鉴别抗性或防御相关蛋白，并通过病原体阐明植物相互作用的机制的方法。

通过比较蛋白质组学分析，我们前期研究发现在南方玉米抗锈病中起着重要作用。

在本研究中，比较蛋白质组学分析显示，差异积累的蛋白参与了氧化还原过程和氧化还原酶活性，表明代谢在茎腐抗性中起作用。

先前的一项研究表明，抗氧化蛋白直接参与了对的防御。

在番茄中过表达一种抗氧化蛋白，增加了清除系统的能力，导致对卵菌病原体的抗性。

抗氧化蛋白也通过催化木质化参与细胞壁的修饰，这意味着植物的细胞壁结构在病原体进入的部位周围发生了变化。

这发生在尖孢镰刀菌进入点周围，并建立了病原体入侵的物理屏障。

在本研究中，比较蛋白质组学、定量逆转录聚合酶链反应和印迹分析证实了抗氧化蛋白抗氧化蛋白是由小麦赤霉菌感染诱导的。

这些结果表明，抗氧化蛋白在玉米对小麦的抗性中起着一定的作用。

对小麦小麦感染后抗氧化蛋白突变体和野生型的核糖核酸-Seq分析显示，DEGs在与抗病相关的通路中起作用，包括丝裂原活化蛋白激酶、热休克蛋白、致病相关蛋白和激素信号蛋白。

植物通常会产生蛋白和激素，作为抵御病原体入侵的一种防御策略。

防御相关的次级代谢物途径，包括苯并恶嗪类和类黄酮类的生物合成，在突变体中下调的DEGs中富集。

苯并恶嗪类是次生代谢物，是有效的防御和先天免疫反应，对抗病虫害。

在之前的研究中，玉米壁相关激酶基因赋予了对北方玉米叶枯病的抗性，这与苯并恶嗪类含量的降低相关。

黄酮类化合物具有多种功能，包括对病原体的防御反应和清除ROS的。

在另一项研究中，在磷酸盐缺乏条件下，类黄酮生物合成的激活增加了棉花植株对大丽花黄萎病的抗性。

综上所述，这些结果表明抗氧化蛋白介导的茎秆抗腐病性与防御导向的转录组重编程之间存在联系。

参考文献

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