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基于光的生物3D打印（如数字光处理，DLP）现在被广泛用于为各种生物医学应用制造几何复杂的结构。然而，固有的光散射缺陷给图案化稀释水凝胶以形成具有精细尺度特征的高保真结构带来了巨大挑战。在DLP打印过程，光在固液两相界面会产生物理散射，细胞的混入会加剧此种散射效应，导致水凝胶在非目标区域固化将会进一步降低打印精度，限制了其在生物医学领域的应用。

针对此问题，来自湖南大学的韩晓筱教授和陈锋副教授提出了一种光吸收与自由基反应协同作用的光散射抑制新机制，基于此机制开发了一种新型光抑制剂（Curcumin-Na，Cur-Na）。这种生物相容性方法显着提高了打印分辨率（~1.2-~2.1像素）和形状保真度（几何误差小于5%），同时最大限度地减少了昂贵的试错程序。通过制造具有复杂的多尺寸通道和薄壁网络的各种支架，证明了使用不同水凝胶图案化3D复杂结构的能力。

相关研究成果以“Photoinhibiting via simultaneous photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting”为题于2023年5月27日发表在《Nature Communications》上。

1. Cur-Na的合成与表征

为了获得水溶性反应性添加剂，作者通过使用碳酸氢钠对姜黄素进行化学改性来合成Cur-Na，由于甲醇中的羟基，姜黄素中的羰基发生酮-烯醇互变异构，形成新的C=C双键（图1a）。C=C双键的形成通过烯烃信号的变化(δ = 5.93 ppm)得到证明，其中出现了代表三取代烯烃的新信号峰（图1b）。

合成的Cur-Na是一种多功能添加剂，可以掺入生物墨水中以提高打印质量。为了验证其对基于光的 3D 生物打印的适用性，最初通过实验评估了吸光度和水溶性。测试表明Cur-Na可以用作光吸收剂，有效防止层的过固化，提高垂直印刷分辨率。此外，Cur-Na的水溶性高达 51 mg·mL−1，使其非常适合配制含水生物墨水。当Cur-Na单体溶解在这种稀释的生物墨水中时，反应性官能团（烯烃的三个C=C双键）可以参与链增长反应，为基本聚合过程提供额外的可控性。

图1 Cur-Na的合成

2. 生物墨水的表征

随后，作者开发了三种预水凝胶制剂用于流变学研究，分别为PEG-GelMA/LAP(对照)，PEG-GelMA/LAP/Tartrazine和PEG-GelMA/LAP/Cur-Na。为了进行比较，采用了光吸收剂酒石黄，因为它具有生物相容性、低毒性和接近打印机光波长（405 nm）的吸收峰。PEGDA和GelMA都是DLP打印广泛采用的典型水凝胶，它们的交联过程受自由基链聚合控制，因此它们适合用于评估光抑制方法的性能。然后对生物墨水进行了光流变学表征，以评估其可打印性并了解Cur-Na如何影响聚合的凝胶化动力学。如图2a、b中的G'值所示，增加两种添加剂的浓度会导致交联密度呈剂量依赖性降低，这意味着过量的光抑制添加剂会降低聚合水凝胶的机械性能。同时，低浓度的Cur-Na足以抑制散射效应，同时不会显着降低刚度（图2c，d）。

此外，三种生物墨水在溶胀率和溶胶分数方面的差异也可以忽略不计，并且观察到较低的溶胶分数值(<6%)，这表明Cur-Na和酒石黄对溶胀和交联动力学的影响有限（图2e，f）。根据上述分析，选择1 mM的酒石黄和Cur-Na浓度进行进一步研究，以确保印刷产品具有快速的印刷速度和适当的机械性能。

图2 生物墨水的物理化学特性

3. 光抑制机制

接着，作者对其光抑制机制进行了分析。首先，DLP中单个微镜投射的光束通常是高斯分布的，其强度从光束中心到周围逐渐降低，服从高斯定律。当入射高斯光束穿透生物墨水时，它会遇到受Beer-Lambert定律约束的指数吸收，会形成了具有高斯分布的光强度，导致图3a中描绘的抛物线状固化区域。固化深度(Cd)决定垂直分辨率，应限制在所需厚度以产生高分辨率的结构。光散射可以通过加宽固化宽度(Cw)来改变固化区域的形状，从而显着降低横向分辨率并导致图案精度差。在细胞存在的情况下，散射效应进一步放大（见图3a）。

当溶解在生物墨水中时，Cur-Na可以通过同步光吸收和自由基反应干扰基本聚合过程，从而减少光穿透并抑制光散射。Cur-Na可以通过更高的反应速率竞争性地抢夺自由基来阻止水凝胶单体聚合形成固化水凝胶。另外，与典型的水凝胶不同，Cur-Na的反应产物是液体，从而避免产生不需要的固化。由于Cur-Na的高反应性，固定浓度的Cur-Na可以在很宽的光强度范围内抑制散射效应，避免重新优化打印参数以制造不同的结构。这种简便的机制可以有效地提高打印分辨率和图案保真度。

图3 Cur-Na抑制散射效应的机理

4. 打印分辨率和保真度

为了证明Cur-Na在提高打印分辨率和图案保真度方面的能力，我们首先定量评估了打印对象的横向分辨率，并比较了之前开发的三组生物墨水之间的分辨率差异。鉴于DLP打印本质上是层叠层聚合材料的过程，因此在多层制造之前研究单层的分辨率是合乎逻辑的。从而制造出具有单层100 μm的辐条状结构。使用不同的光强来测试分辨率对光能剂量的敏感性，这有助于确定印刷参数的公差窗口以及印刷不同结构是否需要重新优化。

图4c显示了印刷结构的显微照片，其中不包括细胞，显示未解决的区域（红色虚线圆圈）作为纯 PEG-GelMA生物墨水和添加酒石黄和Cur-Na的相对曝光强度的函数。可以观察到，纯PEG-GelMA生物墨水表现出最大的未解决部分，并且打印的辐条和设计的辐条（图4a）之间的尺寸差异非常大，这主要是由于散射导致的过度固化。同样明显的是，当光能增加时，未解决的区域会扩大。当向生物墨水中添加1 mM酒石黄时，尽管所有能量剂量的未解析分数都降低了，但曝光强度的分辨率敏感性仍然很明显。在Cur-Na的情况下，分辨率显着提高（图4c）。

图4 横向打印分辨率分析

当细胞被封装时（图4b中的荧光染色图像），纯PEG-GelMA生物墨水的散射效应更加明显，进一步增加了未分辨的区域，从而降低了打印分辨率（图4f)；对于酒石黄，当显着控制散射程度的曝光强度增加时，分辨率会因散射增强而降低。此外，比较用Cur-Na印刷的无细胞（图4d）和细胞负载（图4f）结构，由于前面描述的Cur-Na的散射抑制机制，细胞增强散射对印刷分辨率的影响可以忽略不计。

然后，作者研究了Cur-Na如何抑制多层制造过程中的散射效应，从而提高3D结构的打印质量。具有不同直径（300、500和700 μm）的开放通道的圆柱形样品采用DLP打印，高度范围从0.2毫米到3毫米不等（图5a）。由于主要由散射引起的过度固化，在打印过程中可能会发生通道堵塞（图5b）。为了解决这种影响，采用解析分数（定义为中空部分与通道总长度之间的比率）来表征打印性能。图5c-e分别说明了直径为300、500和700 μm时，解析分数随圆柱体高度的变化。使用添加了Cur-Na的生物墨水成功制造了所有通道，展示了打印3D通道结构的卓越能力。

图5 用于多层制造的空心通道印刷适性分析和用于评估高保真能力的印刷错误分析

为了证明Cur-Na的高保真能力，通过比较设计和DLP打印之间的几何差异进行打印错误分析。该研究设计了具有不同通道直径（900、700、500、300和150 μm）的多通道结构，以评估添加柠檬黄和Cur-Na的生物墨水的印刷误差（图5f）。如图5g所示，使用Cur-Na生物墨水制造了所有开放通道而没有堵塞，实现了直径为150 μm的最小通道。图5h比较了设计直径和测量直径，可以看出，使用Cur-Na打印的通道尺寸与设计的尺寸非常吻合，平均误差小于~5%，打印精度高。

5. 打印3D结构的性能

为了进一步证明Cur-Na复杂3D结构的可打印性，使用PEG-GelMA/Cur-Na生物墨水制造了复杂的支架，包括脊髓支架、血管和陀螺支架（图6）。此外，为了评估Cur-Na对其他细胞的细胞相容性，对先前开发的三组生物墨水进行了PC-12细胞的活/死和CCK-8测定（图7a，b）。可以观察到，PEG-GelMA/Cur-Na水凝胶表现出最高的细胞活力，培养14天后细胞增殖大约增加三倍，甚至高于纯PEG-GelMA生物墨水。

图6 Cur-Na在生成生物医学应用中常用的复杂3D结构方面的分辨率和高保真度能力

为了进一步证明组织工程应用的适用性，作者使用Cur-Na生物墨水制造了具有多个通道（200 μm）的载有细胞的支架（图7c），然后进行体外培养实验以评估细胞生长行为。之后，为了验证Cur-Na和生成的水凝胶是否影响PC-12细胞的分化行为，通过在含有1 mM Cur-Na的分化培养基中培养PC-12细胞和接种进行了两次分化测试生成的3D通道支架表面上的细胞（图7e）。培养7天后，观察到分化和神经突形成，证明了细胞功能研究的潜力。

图7 细胞相容性

总之，本文提出了一种创新的光抑制方法，可以通过同步光吸收和自由基反应的机制有效抑制光基3D打印平台固有的光散射效应。基于这种机制合成了一种光抑制添加剂(Cur-Na)，并通过将这种添加剂掺杂到生物墨水中来展示其优势，包括 (1)显着提高印刷分辨率和保真度；(2)通过取消重新优化程序简化了操作过程，解决了试错问题，具有重要的现实意义和经济意义；(3)在制造具有复杂微型通道和薄壁网络的复杂结构方面的卓越性能，这些结构对于养分运输和氧气渗透具有重要意义；(4)成功制备了对光散射敏感的载有细胞的陀螺支架，经过14天的培养后表现出高细胞增殖和肝功能。(5)这种机制是通用的，适用于其他印刷油墨，只要自由基链增长聚合控制印刷过程。

这种方法提供了一种将多尺度特征赋予组织结构的直接方法，这对于更好地模拟天然组织微环境至关重要。本研究中建立的策略促进了3D生物打印在高保真复杂结构图案化方面的可打印性和可操作性，从而实现更先进的组织工程和再生医学。

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