作者：龚普阳、顾健

2019年12月以来，中国湖北省武汉地区发现新型冠状病毒感染的肺炎患者，随后疫情开始迅速蔓延全国。截至3月8日24时，据31个省（自治区、直辖市）和新疆生产建设兵团报告，累计报告确诊病例80 735例，现存重症患者5 111例。世界卫生组织将其列为国际关注的突发公共卫生事件，并将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”（coronavirus disease 2019）。国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV- 2”，具有传播迅速、传染性强、人群普遍易感等特点，并以发热、乏力及干咳等作为临床主要症状，重症患者则出现呼吸困难、呼吸窘迫综合征及脓毒性休克等。目前，临床尚未出现针对SARS-CoV-2的有效且特异性药物与疫苗，西医主要采用传统的抗病毒药物进行治疗，其不良反应较大且一定程度上缺乏循证依据。中医具有整体观与辨证施治的优势，对该类疫病的认识悠久历史，积累了一系列行之有效的治疗方法。在国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行）》（以下简称《诊疗方案》）第三版至第七版中，中药处方与成方制剂对不同时期COVID-19患者的应用均取得良好的临床疗效。

金花清感颗粒是在2009年北京地区H1N1流感流行期间，北京市中医药管理局组织中西医学专家攻关论证，参考《伤寒论》《瘟疫论》《温病条辨》等中医经典古籍中的百余个处方，借鉴临床专家成果，历经反复筛选并优化而成。金花清感颗粒组方来源于银翘散和麻杏石甘汤方的加减，由金银花、石膏、炙麻黄、知母、连翘、苦杏仁、黄芩、牛蒡子、薄荷、青蒿、浙贝母、甘草共12味药材组成，具有疏风宣肺、清热解毒之功效。组方药味以苦寒药为主，可用于外感时邪引发的发热，恶寒轻或不恶寒，咽红肿痛，咳嗽或咳而有痰。在《诊疗方案》第四版至第七版中，均将金花清感颗粒作为对处医学观察期中具有乏力伴发热症状的推荐中成药。据张伯礼院士介绍，目前已开展的关于金花清感颗粒治疗COVID-19的2项研究表明，该方对于轻度及普通型患者疗效确切，主要体现在退热时间、症状、核酸转阴时间及炎症吸收方面，且有效控制轻症患者的转重率。因此，采用生物信息学手段，对金花清感颗粒防治COVID-19潜在的化学与生物学特征进行初步分析，可为该方进一步的实验研究与二次开发奠定基础。网络药理学是运用系统生物学、高通量筛选、网络分析及网络可视化等多种技术，揭示“疾病-基因-靶标-药物”相互作用复杂体系，从整体性与系统性的角度探析药物对机体疾病网络的干预与影响。基于药物与药物之间结构、功效等方面的相似性，结合机体靶标分子、生物效应的复杂相互作用关系，通过构建药物-药物、药物-靶标等网络，可有效预测药物功能或特定功能所对应的药物，是目前中药药效物质基础研究的重要手段之一。分子对接技术是一种基于受体大分子三维结构与配体化合物的结合作用，通过计算物理化学参数评价二者间的相互作用，从而达到辅助药物筛选的目的，现已广泛用于基于特定靶标的中药及复方活性成分研究。本研究采用网络分析结合分子对接技术，探讨金花清感颗粒中抗COVID-19的潜在物质基础与作用机制，以期为金花清感颗粒防治COVID-19提供科学依据与临床应用参考。

1 材料

本研究材料为数据库与数据分析软件，其中数据库包括中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，）、靶点蛋白数据库UniProt（）、基因功能与信号通路富集分析数据库DAVID（https:// david.ncifcrf.gov/home.jsp）、RSCB蛋白质结构数据库PDB（）、小分子化合物结构查询数据库PubChem（https:// pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）；分析软件包括网络拓扑分析软件Cytoscape 3.2.1、分子对接软件AutoDock Vina、Open Bable GUI、Sybyl及数据可视化软件Graphpad Prism 8、Discovery Studio及在线绘图站Omishare（ tools/index.php/）。

2 方法

2.1 金花清感颗粒中活性化合物及靶标蛋白的筛选

通过TCMSP，以金花清感颗粒中所含11味药材为关键词检索其化学成分。以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）及类药性（drug like，DL）为指标进一步遴选各药味中化学成分[16]。其中，筛选金银花、炙麻黄、石膏、苦杏仁、黄芩、连翘、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷化合物中符合OB≥30%且DL≥0.18的化学成分、甘草符合OB≥50%且DL≥0.18的化学成分作为活性成分，并下载相关化合物的靶点信息。

2.2 靶标蛋白基因名的确定及“成分-靶点”网络的构建

通过UniProt数据库查找相关靶标蛋白的基因名，将查询到的靶点蛋白名称转化为相应基因简称，将药物与成分和成分与靶点数据导入Cytoscape 3.2.1软件中，将2个网络合并构建“药材-成分-靶点”网络。

2.3 靶点的通路分析

为探究靶标蛋白信号转导途径与功能，将筛选得到的金花清感颗粒潜在作用靶点导入DAVID数据库，通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析，选取前20个条目，并用Graphpad软件和在线绘图站Omishare将其结果绘制柱状图与气泡图进行可视化。 2.4 “成分-靶点”的分子对接

首先，从RSCB蛋白质结构数据库（PDB）中下载SARS-CoV-2 3CL水解酶的晶体复合物（PDB ID：6LU7）和血管紧张素转化酶II（ACE2）的晶体复合物（PDB ID：1R42）用于分子对接研究[16]，再运用Discovery Studio软件对靶蛋白中进行修饰，移除其中的配体和非蛋白分子（如水分子等），保存为pdb格式文件，并利用OpenBable GUI软件将其转化为pdbqt格式文件。从PubChem数据库获取小分子化合物的2D结构，并利用Sybyl软件对其进行能量优化，并利用Open Bable GUI软件将其转化为pdbqt格式文件。最后，运用AutoDockVina对其进行分子对接，结合能小于0说明受体与配体间可以自发结合，研究选取结合能≤−5.0 kcal/mol的活性成分作为金花清感颗粒治疗COVID-19靶点的筛选依据。

3 结果与分析

3.1 活性成分的筛选

通过TCMSP检索到金花清感颗粒中11味药材（生石膏除外）的化合物共计1817个，其中金银花含236个，麻黄含363个，苦杏仁含113个，黄芩含143个，连翘含150个，浙贝母含17个，知母含81个，牛蒡子含144个，青蒿含126个，薄荷含164个，甘草含280个。金银花、麻黄、苦杏仁、黄芩、连翘、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷筛选出活性成分（OB≥30%且DL≥0.18，无靶点蛋白的化合物删除）共157个，其中金银花17个，麻黄22个，苦杏仁16个，黄芩32个，连翘20个，浙贝母5个，知母12个，牛蒡子5个，青蒿19个，薄荷9个。筛选甘草活性成分42个（OB≥50%且DL≥0.18）。

3.2 “药材-成分-靶点”相互作用网络

“药材-成分-靶点”网络中共包括441个节点（11种药材节点、154个化合物节点、276个靶点节点）和2 235条边。其中一个节点的度值代表网络中与节点连接的路线数目。通过拓扑学性质中的中心度值（betweenness centrality）、亲中心度值（closeness centrality）和等级值（degree）3个因素筛选网络中较大的节点进行分析，进而确定关键的化合物或者靶点。

从化合物角度分析，有18%的化合物作用靶点≥20个，其中作用靶点≥30个的化合物有22个，通过分析化合物-靶点的中心度值、亲中心度值及等级值等发现，排名前10位的化合物分别为MOL000098、MOL000422、MOL000006、MOL000173、MOL000358、MOL000392、MOL004328、MOL002714、MOL004373、MOL000449，分别能与140、57、54、41、36、34、33、33、32、28个靶点蛋白发生作用。从靶点的角度分析，有7.6%的靶点相互作用的化合物大于30，其中作用靶点≥40个化合物的靶点有13个，排名前10的靶点为PTGS2、HSP90AB1 HSP90AA1、PTGS1、NCOA2、AR、NOS2、PRSS1、SCN5A、ESR1、DPP4分别能与123、100、82、75、72、69、65、62、59、55个化合物发生相互作用。

3.3 GO及KEGG靶点通路富集分析

通过采用DAVID中GO富集分析得到GO条目（P＜0.05），包含192个生物过程（biological process，BP）条目、36个条目涉及细胞组成（cellularcomponent，CC）、50个分子功能（molecular function，MF）条目，主要涉及ATP结合、转录因子活化、炎症反应、细胞凋亡进程调控等与肺损伤相关生物作用。

KEGG通路富集分析筛选得到127条（P＜0.05）信号通路，涉及膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌及T细胞受体通路等，其中乙型肝炎通路涉及E2F1、TNF、MMP9、ELK1、NFKBIA、CXCL8、FASLG等基因；膀胱癌通路涉及E2F1、EGFR、ERBB2、MMP9、TP53、CXCL8、RB1等基因；前列腺癌通路涉及E2F1、HSP90AB1、ERBB2、NFKBIA、PTEN、CTNNB1、AKT1等基因；胰腺癌通路涉及PIK3CG、E2F1、EGFR、RELA、ERBB2、TP53、BCL2L1等基因；小细胞肺癌通路涉及PIK3CG、E2F1、PTGS2、RELA、TP53、NFKBIA、RB1等基因；非小细胞肺癌涉及AKT1、EGFR、E2F1、PIK3CG、PRKCA、MAPK1、CCND1等基因；T细胞受体通路涉及PIK3CG、IL4、TNF、RELA、NFKBIA、IL10、AKT1等基因；选P值较小的20个通路进行可视化。

3.4 金花清感颗粒中核心化合物作用于SARS- CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子对接

一般认为配体与受体相互作用的亲和力越强，所需能量越少，其发生作用的可能性越大。分子对接的结果显示，将金花清感颗粒在“药材-成分-靶点”网络中的中心度值、亲中心度值及等级值综合排名前10位的活性化合物及5种临床治疗药物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2分别进行分子对接。这些化合物与2个酶之间的亲和能均低于5.0 kcal/mol，表明金花清感颗粒中的核心活性化合物与这两个酶均有较好的结合活性。其中，与SARS-CoV-2 3CL水解酶亲和能较低的化合物分别为山柰酚（亲和能为−7.8 kcal/mol）、黄芩素（亲和能为−7.7 kcal/mol）和木犀草素（亲和能为−7.5 kcal/mol）。与此同时，这些化合物与ACE2的亲和能均低于−7.0 kcal/mol，与已报道的文献相符，且其与蛋白之间的相互作用也已报道。此外，与两个蛋白之间亲和结合能较低的化合物还包括豆甾醇、脱水淫羊藿素、β-谷甾醇和芒柄花黄素，为了进一步研究这些化合物与蛋白之间的相互作用，对这4个化合物与蛋白之间的相互作用进行进一步分析。

4 讨论

我国至少有3 000年的疫病历史，自《史记》记载公元前243年“天下疫”开始，共发生大疫500余次。历经在实践中不断探索与深入，中医对于疫病的认识和诊治，总结了大量的临床用药经验，形成了针对疫病独特且完备的理论体系。近代以来，中医药在乙型脑炎、SARS、H1N1流感等重大疫情防控中发挥重要作用，验证并建立了一系列的行之有效的诊疗方案并沿用至今。自武汉COVID-19疫情暴发流行以来，我国先后颁布7版《诊疗方案》，此外全国28个省市自治区也相继发布地区方案，在相关疫苗研制相对滞后，特异性药物缺乏的情况下，中医药已逐渐从过去疫情防控的参与者变为疫情治疗的主力军。COVID-19属于中医的“疫病”范畴，病因多归于“湿或湿热之邪”为主，其核心病机集中于“寒、湿、热、瘀、闭、虚”等证候要素。初期以“解毒袪邪”为主，后期以“扶助正气”为主，总体的治疗原则以“疏表透邪，宣肺肃降，通腑泻浊，理气活血”，使得阴阳汇通，阴平阳秘。

金花清感方是针对甲型H1N1流感治疗的方剂，由具有2 000多年治疗发热性传染病用药经验的“麻杏石甘汤”与具备200多年治疗温热疫病的“银翘散”调配组合而成。该方在治疗流感风热犯肺证的双盲随机对照临床试验中，可降低患者退热时间及退热率，改善以发热、头身疼痛、咽红咽痛为主症的中医临床证候表现，提高病毒转阴率，且证实在常规剂量治疗下安全有效。从临床表现来看，H1N1流感以“热毒”为主，COVID-19以“湿毒疫”为主，二者虽然病机病因不同，但发热是其同性特征。在金花清感颗粒药理作用研究方面，其可降低流感病毒肺炎小鼠模型的死亡率，延长生存时间，并减少肺组织病变。在本方组成药味中，金银花、连翘、甘草、黄芩等多种药材提取物与成分具有抗流感病毒或呼吸道合胞病毒作用。金花清感颗粒作为《诊疗方案》所推荐中成药，其解热与抗病毒双重作用能有效改善COVID-19患者的临床症状。因此，本实验采用网络药理学及分子对接技术，进一步对金花清感颗粒中潜在的活性成分进行挖掘，并探讨其可能的作用机制。

网络药理学分析结果显示，金花清感颗粒中主要活性成分和综合评分最高的10个化学成分中有8个黄酮类及2个甾醇类化合物。将10种化学成分分别与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2进行分子对接，显示其结合能力均优于临床推荐用化学药瑞德西韦、洛匹那韦及利托那韦，并与利巴韦林相近，进一步证实了网络药理学的成分筛选结果。综合对两种酶的结合能力，表明金花清感颗粒中芒柄花黄素、豆甾醇、β-谷甾醇、去甲脱水淫羊藿黄素为潜在的抗COVID-19活性成分。网络药理学所预测的排名前3的靶点分别为PTGS2、HSP90AB1、HSP90AA1。结合现有报道与KEGG分析结果，显示与肺炎相关的信号通路主要有TNF、PI3K/Akt等，涉及病毒、细菌、免疫调节及炎症反应等多方面生物效应。金花清感颗粒中关键成分是否可通过作用于PTGS2、HSP90AB1、HSP90AA1调节相关通路达到改善COVID-19作用仍需相关实验研究进一步证实与探讨。 目前，由于对SARS-CoV-2开展相关体内外研究所需实验条件的限制，采用大数据网络分析及虚拟辅助药物设计对抗COVID-19药物进行初步筛选显示一定的技术优势。已有学者采用该类方法对中药方剂抗COVID-19的活性成分进行预测。通过总结已有报道发现，虽然藿香正气口服液、达原饮、清肺排毒汤、抗病毒颗粒等一线临床用药在药味组成上具有差异，而对其所预测筛选得到的抗COVID-19核心化合物中大多存在黄芩素、槲皮素、木樨草素等黄酮类物质。结合本文研究结果，同样证实了黄芩素、木犀草素等黄酮类成分可能对COVID-19具有药效作用，除此之外，并进一步发现了去甲脱水淫羊藿黄素、β-谷甾醇和豆甾醇的潜在活性。因此，以多种临床有效制剂中所筛选得到的共性成分为载体，开展抗SARS-CoV-2相关实验研究，有利于推动源于中药的抗冠状病毒药物的开发与应用。

综上所述，本研究基于网络分析与分子对接技术，以金花清感颗粒为研究对象，对其中所含的化学成分、作用靶标及其关键药效成分与ACE2的结合能力进行分析，初步探索了金花清感颗粒用于防治COVID-19可能的物质基础与作用机制。本研究可为进一步针对中药活性成分开展抗COVID-19药物的筛选和评价提供数据支持和理论依据。