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全球已知的海草种类有70余种,隶属于6科13属;中国现有海草22种,隶属于4科10属,主要分布于海南、广东、广西、台湾、山东和辽宁沿海。

大面积聚集生长的海草称之为海草床,作为海洋的三大典型生态系统之一,海草床具有十分重要的生态服务功能:是最具生产力的海洋初级生产者之一,海草床可以净化水质、加固海底底质;为多种海洋动物提供食物来源和育幼场所,包括经济鱼类和贝类;海草床在捕获和保存碳方面起着重要作用,扮演了碳汇的重要角色。

另外,海草场的存在能使人类和海洋生物的潜在致病菌的相对丰度降低50%。

植物内生菌是指在植物的生命周期中,能够在植物组织内定殖而不会对宿主造成明显伤害的微生物类群。

内生菌能够保护植物免受生物和非生物胁迫。

内生菌通过产生化合物,对植物病原体和食草动物具有抑制生长的活性。

同时,内生菌能够提高植物对胁迫的耐受性,包括耐盐、耐旱、耐寒,并保护植物免受氮和水分胁迫。

一些内生菌可合成植物生长激素、腺嘌呤和多胺等化合物,从而促进植物宿主的生长和发育。

通过固氮获得养分是内生菌促进植物生长的另一个机制,N是限制植物生长的主要因素,固氮内生细菌作为生物肥料的应用已成为提高作物生长和产量的最有效方法之一。

内生固氮菌主要定殖在植物的细胞间隙和木质部导管中,内生固氮菌所固定的氮除了能够满足自身的生长需求之外,还能被植物吸收利用,从而促进宿主植物的生长及其对环境的适应,尤其是在含氮量较低的环境中。

自20世纪90年代以来,全球的海草床以每年7%的速率在衰退,而生长在海草叶、根和根茎中的微生物能够介导代谢物交换和生物地球化学的转化,这对海草的生长和海草床的生态恢复至关重要。

喜盐草根际微生物的添加明显促进了泰来草的生长,另外鳗草根际不同的固氮菌对鳗草的存活和生长也有着不同程度的提高和改善,但是目前关于海草内生菌在海草床修复中的研究仍属于空白。

泰来草(Thalassia hemprichi)是广泛分布于热带和亚热带海域的典型海草,本研究以海南省新村湾泰来草为研究对象,基于16S rRNA和固氮基因nifH建立克隆文库,研究海南省新村湾泰来草内生细菌和内生固氮菌的多样性、群落结构,为海草内生菌的进一步研究和微生物资源的挖掘提供理论基础,有助于推动海草床的生态修复。

材料和方法

样品采集

泰来草于2020年5月采自海南省新村湾(18°24’N,109°58’E),退潮后用无菌铲采集泰来草,将其装入无菌采样袋后带回实验室,4°C保藏,于24 h内进行表面消毒。

样品表面消毒

挑选组织完整、无病变的泰来草根(Root)、地下匍匐茎(Rhizome)、叶(Leaf)在流水下冲洗干净表面的泥沙及其附着物后,用0.05%的HgCl2消毒3 min,用ddH2O震荡洗涤4次,每次2 min,并将最后一次洗涤液分别涂布于2216E、MA、LB固体培养基上,28°C培养72 h,如果固体培养基上未有菌落长出,则认为海草表面已彻底消毒。

将表面彻底消毒的泰来草根、茎、叶,每个样本3个重复,液氮冷冻后,冻存于–80°C。

DNA提取、PCR扩增和克隆文库构建

海草组织用无菌手术剪剪碎后进行研磨,再使用E.Z.N.A.®土壤DNA试剂盒(Omega,USA)根据说明书进行DNA提取。

用引物799F(5’-AACMGGAT TAGATACCCKG-3’)和1392R(5’-ACGGGCGGTGT GTRC-3’)进行16S rRNA的第1轮扩增。

第1轮PCR产物使用E.Z.N.A.®胶DNA试剂盒(Omega,USA)根据说明书进行DNA目的片段的回收。

用引物799F(5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)和1193R(5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’）以第1轮PCR扩增产物为模板进行16S rRNA的第2轮扩增。

第2轮PCR产物同样使用E.Z.N.A.®胶DNA试剂盒(Omega,USA)根据说明书进行DNA回收。

使用引物Pol-F (5’-TGCGAYCCSAARGCBGA CTC-3’)和Pol-R (5’-ATS GCCATCATYTCRCCG GA-3’)扩增固氮功能基因nifH。

PCR产物进行胶回收。

16S rRNA的第2轮胶回收DNA和nifH基因片段分别与p MD 18-T载体(TaKaRa,Japan)连接后转入大肠杆菌DH5α (全式金,中国)中,进行蓝白斑筛选,随机挑选阳性克隆子,构建克隆文库。

测序结果和数据处理

用BioEdit对原始桑格序列进行修成,去除载体、引物序列、嵌合子和低质量序列,得到有效拼接片段。

对于nifH序列,仅保留能够成功翻译成氨基酸的序列。

基于97%的序列相似性,使用软件Mothur (V1.35.1)将序列分为不同的分类操作单元(Operational Taxonomic Unit,OTU)并计算Alpha多样性指数。

利用NCBI数据库(Nucleotide collection,nr/nt)对OTUs代表序列进行物种注释。

利用Excel2016对序列信息进行整理并绘制群落的相对组成图和韦恩图,利用PRIMER 5进行聚类分析和非度量多维尺度分析,R (3.5.1) vegan包进行ANOSIM显著性检验。

通过软件MEGA 7以Neighbor Joining法构建系统发育树,利用Bootstrap=1000进行可信度检验。

结果与分析

泰来草根茎叶内生细菌的多样性和群落结构

基于OTUs计算Alpha多样性指数(Shannon、Simpson和Chao指数),并对泰来草内生细菌的群落丰富度进行分析。

结果显示,与地下匍匐茎、叶相比,泰来草根中内生菌的Chao指数最高(268.00),说明根中微生物的物种丰富度最高;而Shannon指数最高、Simpson指数最低的是叶片,分别为3.22和0.08,说明泰来草叶片的内生细菌群落多样性最高。

如表1所示,新村湾泰来草内生细菌16S rRNA克隆文库由808条序列组成,根、茎、叶的内生细菌序列数分别为309、271、228条,克隆文库的覆盖度为84%—94%。

根据序列相似性阈值为97%划分可操作分类单元(OTU),得到162个OTUs,根、茎、叶分别含有72、45、52个OTUs。

如图1、图5所示,新村湾泰来草的主要内生细菌群落为变形菌(Proteobacteria,76.11%)、放线菌(Actinobacteria,20.79%)、拟杆菌(Bacteroidetes,1.11%)、厚壁菌(Firmicutes,0.62%)、Ignavibacteriae (0.25%)、酸杆菌(Acidobacteria,0.37%)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes,0.25%)、浮霉菌(Planctomycetes,0.37%)和螺旋体门(Spirochaetes,0.12%) 9个门。

如图2、图5所示,在变形菌中,主要包括α-变形杆菌(A l p h a p r o t e o b a c t e r i a,5 2.9 7%)、β-变形杆菌(B e t a p r o t e o b a c t e r i a,3.7 1%)、γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria,17.33%)和δ-变形杆菌(Deltaproteobacteria,2.10%) 4个纲;在放线菌中,主要包括酸微菌纲(Acidimicrobiia,13.86%)、放线菌纲(Actinobacteria,6.81%)和红蝽菌纲(Coriobacteriia,0.12%) 3个纲;在拟杆菌中,主要包括拟杆菌纲(Bacteroidia,0.12%)和Flavobacteriia (0.99%) 2个纲;在厚壁菌中,主要包括芽孢杆菌纲(Bacilli,0.62%) 1个纲;在浮霉菌中,主要包括浮霉菌纲(Planctomycetia,0.12%)和Phycisphaerae(0.25%) 2个纲。

泰来草的根、地下匍匐茎和叶内生微生物中相对丰度最高的类群均为α-变形杆菌,相对丰度分别为49.84%、48.34%、62.72%;其次为γ-变形杆菌(8.41%、33.21%、10.53%)。

另外,酸微菌纲(34.63%)和放线菌纲(13.16%)分别是根和叶的另一优势类群。

表1 不同泰来草组织内生菌和内生固氮菌群落多样性分析

图1 门水平泰来草内生细菌的相对组成

图2 纲水平泰来草内生细菌的相对组成

如图3A所示,叶片、地下匍匐茎和根仅共有1种内生微生物OTU,属于α-变形杆菌、根瘤菌目(Rhizobiales)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)。

与地下匍匐茎、叶相比,泰来草根中特有的微生物物种丰富度最高,含有72个OTUs。

地下匍匐茎和叶所特有的微生物分别有30、35种。

Acidobacteria＿Gp23、红蝽菌纲、Ignavibacteria、浮霉菌纲、Spirochaetia和Thermoanaerobaculia只出现在泰来草的根内,拟杆菌纲则只出现在泰来草的地下匍匐茎内。

基于OTUs对泰来草内生细菌进行层级聚类分析和非度量多维尺度分析,新村湾泰来草的根、地下匍匐茎和叶片的内生菌群落结构具有显著差异(R=1,P≤0.01)。

海草的器官(根、地下匍匐茎、叶片)作为内生微生物宿主,为其提供直接的生存生境,这反映了内生细菌对宿主独特生境的适应性。

图3 泰来草内生细菌(A)和内生固氮菌(B)的Venn分析

图4 基于16S rRNA OTUs泰来草内生细菌聚类分析(A)和非度量多维尺度分析(NMDS,B)

泰来草根茎叶内生固氮菌的多样性和群落结构

泰来草不同营养器官的Alpha多样性指数计算结果(表1)显示,泰来草根中固氮菌的Shannon和Chao指数均高于叶片和地下匍匐茎中固氮菌的Shannon和Chao指数,分别为3.01和116.13,说明在三者中,泰来草根的内生固氮菌群落的物种丰富度和多样性最高;地下匍匐茎的Shannon指数最低,Simpson指数最高,说明其群落的多样性最低。

新村湾泰来草内生固氮菌克隆文库由933条nif H序列组成,归属于90个OTUs,克隆文库的覆盖度范围为91%—99%。

系统发育分析结果显示,新村湾泰来草的主要内生固氮微生物群落为变形菌(90.03%)、蓝细菌(Cyanobacteria,9.22%)、疣微菌(Verrucomicrobia,0.75%)。

在变形菌中,主要包括α-变形杆菌(54.66%)、β-变形杆菌(0.21%)、γ-变形杆菌(34.08%)和δ-变形杆菌(1.07%) 4个纲;在蓝细菌中,主要包括Lusitaniella、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)和聚球藻纲(Synechococcales) 3个纲。

其中,α-变形杆菌是新村湾泰来草根、茎和叶内生固氮菌共有的优势类群,其相对丰度分别为47.73%、48.99%和67.65%;同时,γ-变形杆菌也是茎和根的另一优势类群,分别为45.27%和46.53%。

如图3B所示,与茎、叶相比,泰来草根内生固氮菌的物种多样性最高,含有59个OTUs,地下匍匐茎含有19个OTUs,叶片含有27个OTUs。

地下匍匐茎和根共有11个OTUs;三者共有2个OTUs;根所独有固氮菌类群最为丰富,含有47个OTUs;地下匍匐茎和叶独有的OTUs分别为7个和23个。

颤藻亚纲和聚球藻纲是叶片特有的类群,相对丰度分别为2.94%和9.48%;Lusitaniella是泰来草地下匍匐茎特有的菌群,其相对丰度为5.74%;β-变形杆菌和δ-变形杆菌是根独有的类群,相对丰度分别为0.60%和3.02%。

基于nifH OTUs对泰来草内生固氮菌进行层级聚类分析和非度量多维尺度分析,结果表明:新村湾泰来草的根、地下匍匐茎和叶片的固氮菌群落结构具有显著差异(R=1,P≤0.01),与细菌相似,同样反映了固氮菌群对海草宿主独特生境的适应性。

系统发育分析结果显示,新村湾泰来草的内生固氮菌主要分属于颤藻亚纲、聚球藻纲、α-变形杆菌、β-变形杆菌、γ-变形杆菌和δ-变形杆菌。

泰来草不同营养器官之间的优势OTUs存在差异:OTU13、OTU46、OTU24、OTU80、OTU15、OTU4、OTU70和OTU74仅出现在泰来草叶中,然而OTU16、OTU5、OTU32、OTU35、OTU16、OTU1和OTU11主要分布于地下匍匐茎,OTU34、OTU30、OTU3、OTU29和OTU6主要分布于根,OTU7、OTU27、OTU9、OTU22、OTU10、OTU20、OTU21、OTU14、OTU19和OTU18主要出现于地下匍匐茎和根。

图5 基于16S rRNA泰来草内生细菌邻接法系统发育进化树

图6 纲水平泰来草内生固氮菌的相对组成

图7 基于nifH OTUs泰来草内生固氮菌聚类分析(A)和非度量多维尺度分析(NMDS,B)

海草的叶片、地下匍匐茎、根作为三个相互联通的营养器官,在某些层面对海草具有不同的生理功能,例如叶片的主要功能是光合作用,因此三者在一定程度上又是相互独立的,为微生物提供相互作用而又独立的生态位,对内生细菌群落结构的影响具有显著差异性。

本文以海南省新村湾泰来草的不同营养器官中(根、地下匍匐茎、叶)的细菌和固氮菌为研究对象,通过构建克隆文库对新村湾泰来草内生细菌和内生固氮菌的多样性和群落结构进行探究,研究结果显示泰来草不同组织的内生细菌和内生固氮的菌群落结构均具有显著差异,这也反映了内生菌对宿主生态位的适应性,这与Garcias-Bonet等人对波喜荡草(Posidonia oceanica)内生细菌群落的研究结果一致。

泰来草根中细菌的物种丰富度最高,叶片中细菌的多样性最高;而泰来草根中内生固氮菌的物种丰富度和多样性均最高,叶片、地下匍匐茎的依次降低;这表明内生细菌群落结构具有宿主器官特异性,这或许是因为微生物直接或间接的参与了宿主的生命活动,在不同的宿主器官内采纳了不同的适应策略。

另有研究表明:内生细菌群落结构不只与植物组织有关,还会受到地点、宿主的健康状态、生命周期、宿主的生存环境的影响。

此外,植物种类、发育时期和外界环境都会对内生菌的群落结构产生影响。

变形菌和放线菌是新村湾泰来草内生细菌的优势类群;而江玉凤等人的研究同样表明,变形菌是新村湾泰来草细菌群落的优势菌;Garcias-Bonet同样发现,变形菌是地中海泰来草、喜盐草、海菖蒲的优势内生菌;另外,Garcias-Bonet等利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对地中海波喜荡草的内生细菌群落进行研究,结果表明其主要OTUs属于变形菌和拟杆菌;Aravindraja等人的研究也证实了变形菌是海草Cymodacea sp.的优势菌。

变形菌分布广泛,是植物内生细菌中最普遍的类群,在陆地植物、农作物中均有分布:沙月霞、吴燕燕等通过高通量测序,分别发现变形菌是水稻宁粳43号、桑树的优势内生菌群落之一,且是丰度最高的类群;同时变形菌还是高原植物、苏铁等观赏植物、野番石榴等水果的优势内生菌群,这说明变形菌或许已经适应绝大多数植物生态位,并间接或直接参与了植物的生命活动。

此外,放线菌、拟杆菌和厚壁菌也是内生细菌群落中十分常见的类群,但这些菌的相对丰度会随着宿主植物种类的不同而不同。

图8 基于nifH蛋白基因序列泰来草内生固氮菌系统发育进化树,(A)蓝细菌,(B)变形菌

表2 泰来草固氮菌中部分OTUs的分布及物种注释

泰来草根、地下匍匐茎、叶片的内生菌群落都存在一些独有的OTUs,Grady等人的研究支持了生态过滤器的存在,这种过滤器的存在有利于某些类群,而不利于其他类群;这样的过滤可能是由于宿主植物的选择、环境的过滤、微生物类群之间的竞争排斥,或者三者的结合。

同样的,泰来草的不同组织处于不同的环境、生态位,其组织结构也不一样;而不同种类的微生物之间又存在着种间竞争,某些种类微生物的存在,会对其他种类内生菌的生长和定殖产生不利影响,因此,泰来草根、地下匍匐茎和叶之间的内生菌群落结构存在显著性差异。

内生菌是一类十分重要的微生物资源,能够与宿主互利共生;研究证明其在促进植物生长和病害防治方面具有十分重要的意义:张国霞等从野生水稻Oryza rufipogon中分离到22株具有固氮能力的内生菌,其中有21株能够使水稻苗的茎和根显著增长;植物内生菌的提取物对水稻的生长具有显著影响。

从金钗石斛分离获得的芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)内生菌,能够促进玉米种子的萌发,并能够通过产IAA帮助宿主植物缓解干旱胁迫。

另外,内生细菌能够通过提供氮源和保护植物免受有毒硫化物的入侵,在植物的健康方面发挥重要的作用。

固氮菌是一类具有固氮功能的原核生物,属于细菌范畴。

有趣的是,新村湾泰来草中内生固氮菌的群落聚类与内生细菌的群落结构是不同的,对于内生细菌,地下匍匐茎与叶片的群落结构更为相似,聚类成一个cluster,对于内生固氮菌,地下匍匐茎与根的群落结构更为相似,聚类成一个cluster。

这或许可以表明,虽然海草的地下匍匐茎与叶片具有截然不同的生理功能,内生细菌对其采用了不同的适应策略,但最终殊途同归,形成较为相似的群落结构。

而地下匍匐茎、根的主要功能是从沉积物中汲取营养,例如NO3–,其内的固氮菌在为宿主提供NO3–的过程中形成了较为相似的群落结构,正所谓同途同归。

另外,本研究发现泰来草叶片中存在大量的固氮蓝细菌,相对丰度约为22.55%。

蓝藻在硝酸盐还原、固碳和维持海草对氮源的需求等方面具有重要的作用。

蓝藻能够通过固氮为宿主植物提供大量的氮源和其他代谢物,宿主植物会尽可能地利用共生蓝藻所固定的氮,而不是将其排出植物体外。

另外,植物内蓝藻分布的组织具有大量的粘液多糖蛋白,是土壤微生物入侵植物的另一道屏障;共生蓝藻还能为宿主提供营养,减弱了植物对其的免疫反应,两者因此进一步建立更加稳定和高效的共生关系。

海草共生蓝细菌在海草生命活动(包括抗逆性,例如抵御高温)中扮演的角色还需要进一步的研究。

本文以新村湾泰来草为研究对象,证实了泰来草中存在丰富的菌群,多样性较高,且具有器官特异性。

共生微生物具有植物宿主器官特异性,泰来草根、地下匍匐茎、叶中内生细菌、固氮菌的群落结构具有显著差异,这表明这些微生物对植物宿主器官的独特适应性。

叶片中的内生细菌的多样性最高,根中的内生固氮菌多样性最高,由此推测泰来草的根将是挖掘固氮微生物的主要资源。

本研究结果可为挖掘海草功能微生物提供新的视野。

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