该篇实验方法已经在Nucleic Acids Research文章“Inducible directed evolution of complex phenotypes in bacteria”中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在Bio-protocol期刊，欢迎大家进入Bio-protocol期刊直接与作者交流。

简 介

在这篇Bio-protocol文章中，来自美国北卡罗来纳州立大学的研究人员开发了一种结合最近连续定向进化方法的特异性和吞吐量以及ALE的简易性的新定向进化方法（Inducible Directed Evolution，IDE）。

亮 点

1. 在本方法中，作者介绍了诱导式定向进化（IDE）的详细操作方法，通过一系列简单的孵化步骤使长的（高达85kb）DNA序列以高通量的方式进行变异，产生可筛选的大数据突变体库，并获得所需的表型。

2. 本方法结合了基于噬菌体的定向进化方法的关键部分，包括诱导性诱变质粒，以及将诱变的DNA转移到未突变的细胞的噬菌体，避免了脱靶基因组突变，并使诱变和筛选步骤脱钩，使其成为优化大肠杆菌复杂表型的有力工具。

背景介绍

由多个基因综合作用而产生的表型被定义为复杂表型。限制这些表型的基因通常很难确定。因此，需要多样化的组学方法以快速的方式筛选改进的变体以改善这类表型。适应性实验室进化（ALE）提供了全基因组的多样化，用于研究能够驱动微生物菌株在特定压力下适应的机制和变化。然而，基因组随机突变的积累使ALE结果的解释变得复杂。

而定向进化方法则可以将突变限制在一个确定的DNA序列上，避免了随机突变，可用于识别确定的DNA序列中的有益突变，改善所需的表型。然而大多数方法无法进化出优化复杂表型所需的大序列DNA，原因是大质粒的转化效率差，或基于M13-噬菌体的方法包装限制，如PACE。

在这里，研究人员介绍了诱导进化（IDE），一种使用P1噬菌体进化大型DNA途径的方法，其大包装极限（5-100kb）使更大的DNA序列能够在细胞间穿梭。IDE的工作流程既快速又简单适应。首先，通过将所需的DNA序列克隆到噬菌体骨架中来制备多样化菌株。一旦构建了噬菌体，就将其转化到多样化菌株上。含有P1噬菌体、诱变质粒和噬菌体的多样化菌株进行诱变。诱变步骤完成后，可以在适当的菌株中产生多样化的噬菌体进行筛选/选择。这个周期可以重复进行，直到改进停止，或获得所需的表型。

步骤节选

step A. Construction of phagemid (PM)

step B. Construction of Mutagenesis Plasmid (MP)

step C. Preparation and transformation of electrocompetent cells to generate Diversification Strain

step D. Induction of mutagenesis

step E. Phage production

step F. Phage infection

step G. Introduction of P1 phage into P1-free strains for desired screening strains

step H. Screening/Selection

step I. After screening is complete

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