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01清洁实验环境

将消毒液彻底喷洒在层流安全柜内，并用纸巾擦干净。将用过的纸巾放入适当的垃圾桶中。将70%的乙醇喷洒安全柜内，并用纸巾擦干净。安全柜现已清洁，可供使用。

02处理细胞悬液

从冰箱中取出细胞培养基和胰蛋白酶，放入37℃的二氧化碳培养箱中使其升温。使用显微镜观察待计数细胞，检查是否有可见的细菌和真菌污染迹象。用70%的乙醇喷洒培养基瓶和移液管，放入安全柜内。轻轻晃动培养基瓶以确保悬浮细胞充分混合在悬浮细胞发生沉淀之前，取0.5毫升的细胞悬液样本，保存在无菌微量离心管中。去除贴壁细胞上残留的培养基。 用常温的DPBS溶液洗涤，加入EDTA胰蛋白酶使细胞分离(DPBS溶液和蛋白酶的用量见表)。放置到37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养2~5分钟。（培养时长视细胞类型而定）。取出放倒置显微镜下进行观察，发现胞突回缩、细胞间隙增大以及细胞从培养瓶底分离为单个细胞。待所有细胞分离完成，37摄氏度含有10%胎牛血清的培养基中和EDTA胰蛋白酶（用量见表）。

上下晃动细胞悬浮液三次，使细胞复苏，然后转移到15毫升的试管中。在室温下，以每分钟1000转的速度，离心细胞悬浮液，持续5分钟。离心结束后，弃去细胞混悬液。然后用37摄氏度含有10%胎牛血清的培养基使细胞颗粒悬浮至原始培养体积。用5毫升的无菌移液管取0.5毫升的细胞悬液样本转移到无菌微量离心管中。

03准备血球计数器

如果使用玻璃血球计数器和盖玻片，请在使用前用酒精清洁。用水润湿盖玻片，并将盖玻片固定到血球计数器上。如果盖玻片下出现牛顿折射环，则表明盖玻片已正确附着。 如果使用一次性血球计数器（例如 INCYTO DHC-N01），只需在使用前将其从包装中取出。

04开始计数

取 100 µL 细胞放入新的微量离心管中，加入 400 µL 0.4% 台盼蓝（最终浓度 0.08%），轻轻混合。小心地将一滴悬浮液滴入计数室的孔中，使细胞悬液通过毛细管作用被吸入。使用倒置显微镜，在 10x 物镜下对焦到血球计数器的4*4网格线上。计数未被染色的活细胞计数。计数时，只计方块内或右边界及下边界线上的细胞。按同样的方法，必要时也可计数台盼蓝染色的死细胞以估计活细胞的比例。移动血球计数器到下一组方块（16个），继续计数，直至所有 4 组方块（每组16个）均计数完毕。

05计算活细胞数量

计算每组方块（16个）中细胞计数的平均值并记录它们的值来计算细胞浓度。取4组16个方格中活细胞的平均数，乘以10000，得到每毫升的细胞数。乘以5，以修正加入台盼蓝时的 1:5 稀释。最终值即是原细胞悬液中的活细胞数量/mL。例：·如果每 16 个方块的细胞计数是 50、40、45、52，则平均细胞计数为：(50 + 40 + 45 +52) ÷ 4 = 46.7546.75 x 10000 (104) = 467500467500 x 5 = 原细胞悬液中 2337500 个活细胞/mL

06计算细胞活力

将活细胞和死细胞计数相加，得到总细胞计数。活细胞计数除以总细胞计数即计算出百分比活力。

例：

活细胞计数：2337500 个细胞/mL

死细胞计数：50000 个细胞/mL

2337500 + 50000 = 2387500 个细胞

2337500 ÷ 2387500 = 97.9% 活力

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