文|胡一舸

编辑|胡一舸

前言

高丰度、高纯度的DNA的分离提取经常会成为对很多农业中的重要性状展开基因分析的制约因素。

因为DNA与组蛋白之间存在着密切的联系，所以在含有大量蛋白质、多糖类物质的干种子中，想要提取出高质量的DNA的困难非常大。

DNA样中混杂的酚类、色素、多糖和蛋白质等还会对DNA聚合酶、连接酶和限制性核酸内切酶等生物酶的活性产生影响，从而对接下来的试验进行产生影响。

要想要解决这个问题，最关键的就是在DNA提取的过程中，如何有效地去除蛋白质、多糖、色素等杂质。

以此为基础，现在已经可以看到很多的关于从种子中提取DNA的试验方法，比如Chunwongse等发明了从大米和小麦中用半粒种子提取DNA的方法。

Mcdonald等人以及Kang等人提出了一种从像棉花，花生，大豆这样的作物中抽取DNA的方法，目前，有关油菜与近缘种的DNA的研究还比较少见。

谢景梅等采用改进的CTAB法，从黑籽和黄籽油菜中获得了DNA样本，样本溶液A260/A280，显示出DNA样本浓度偏低。

丹巴等采用SDS和CTAB法，从西藏油菜中获得了适合SSR检测的DNA样本，但仅限于油菜，其他两个品种，甚至是油菜的近缘种均没有得到应用。

沙爱华等采用简化的CTAB法，从油菜中获得了一定数量的DNA样本，但样本溶液浓度偏低，无法进行RAPD和SSR检测。

针对这一现状，本项目拟在前期研究的基础上，针对油菜、甘蓝等三种油菜类作物的籽粒富含油脂、蛋白质、碳水化合物以及次级代谢产物的特性。

综合国内外有关油菜类作物的全基因组DNA的研究进展，并以油菜类作物的全DNA为参照，尝试从油菜类作物的干籽中进行DNA的高品质提取。

从而构建一套适合油菜类作物的高品质DNA的提取技术体系，为科学研究、杂种纯度鉴定、种质资源的遗传多样性研究等提供理论依据。

干种子基因组DNA提取

油菜的三大栽培类型：陇油2号系甘蓝型油菜、天油5号系白菜型油菜、靖油1号系芥菜型油菜，油菜的两种近缘植物：武威毛角系白芥、和田芸芥系芸芥，均由甘肃省张掖市河西学院农业与生物技术学院农学教研室提供 。

50mmol/L/LEDTA，氯仿-异戊醇，3摩尔/LNaCl溶液，TE缓冲溶液（pH8)，3%CTAB，1%GoldViewI核酸增强剂，ddH2O，10×Buffer，1×TAE电泳缓冲溶液，1×BaqDNA聚合酶，1个TAE电泳缓冲溶液和1个随机引物。

将干燥的籽粒0.5克放入研钵内，用碾棒将其碾碎，然后加少量的石英沙，将其碾碎为粉末状，再加700微升的萃取物，再碾碎为均匀的浆状物。

将均匀的浆液移至离心机中，放入65℃的温水中15min，每5min轻摇一次，使之完全溶解，然后将500微升的氯仿-异戊醇添加至所述的溶液中，混合，然后以12000rpm的速度进行5min的离心，以获得上清溶液（A)。

将100uL3摩尔/LNaCl的100uL上清液A加到300uL上清液中，然后摇动，再加600uL预先冷却的无水酒精，然后进行冰浴放置10分钟，在每min的温度下以每min12000rpm进行离心，获得沉淀物（A)。

将1摩尔/升NaCl的300微升1摩尔/升的氯化钠溶液添加至沉淀剂A，当沉淀剂溶解后，又将300微升氯仿-异戊醇添加至沉淀剂A，轻微混合均匀，以每秒12000rpm的低温离心5min，获得上清液（B)。

将30uL1mol/LNaCl溶液及600uL预冷的无水酒精按顺序添加至300uL上清液B中，冰浴静置10min，4℃下12000rpm的离心10min，获得沉淀（B)。

将300微升75%酒精添加到沉淀物B中，进行2次水洗并使沉淀物自然干燥，将100µL的TE溶液加到pH值为8的溶液中，使之完全溶解，得到染色体DNA样本溶液，储存于-20℃，待用。

以之前本研究中的DNA提取方法得到的甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、白芥和芸芥五份DNA为基础，使用10条随机引物，分别对它们展开了扩增。

反应总体积为25μL:18.5μLddH2O、2.5μL10×buffer、1UTaqDNA聚合酶、1μL引物、1μL模板DNA。PCR扩增反应在MycyclerTM热循环仪上进行。

PCR扩增反应的流程是：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，37℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，扩增35个循环，最后72℃延伸10分钟。

用Nanaphotometer核酸蛋白分析仪测定，上述五份基因组DNA样品的OD260/OD280、OD260/OD230、OD320值和浓度。

采用本文所述的萃取方式所得到的全基因组DNA，每个样本液体取1微L，添加6微LLoadingbuffer，以1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，以1%的琼脂糖凝胶进行PCR扩增产物的PCR扩增产物。

以1×TAE作为缓冲剂，以5V/cm的方式进行40min的凝胶成像，对DNA完整性和扩增产物多态性进行检测，并对其进行照像和存储。

实验结果与分析

如图1所示，第1，2，3，7，9个泳道的DNA条形清楚，没有明显的尾巴，说明DNA没有退化。

在第4、5、6个泳道中，DNA的主要条带是模糊的，呈现出清晰的地毯条带，这说明DNA样品已经发生了很大程度的退化，而且还夹杂着一些杂质。

在第八和第十个泳道中，虽然DNA的主要条带比较清晰，但是其带形为“之”字形，并且在泳道中还存在着一些“拉长”的痕迹，这说明DNA存在着轻度的退化，并且还夹杂着一些杂质。

OD320为的是检测DNA样本溶液的浑浊度以及其他干扰因素，所以这个值应该是接近0的。

从表2可以看出，在使用本试验的方法提取时，OD320的测定值在0.000~0.002之间，其平均值为0.0008，接近于0，这说明所抽提DNA样本中悬浮物的量很小。

而用控制法萃取后，OD320测定值在0.008-0.01范围内，平均为0.0262，显著高于0.000，说明所萃取的DNA样品中存在一定数量的悬浮物质。

如果所测量的DNA样品具有OD260/OD280≈1.8，则表示所提取的DNA样品的纯度比较高，没有出现蛋白污染。

而用控制方法提取时，OD260/OD280的值在1.250~1.677之间，平均值为1.4238，显著低于1.8，这表示所提取DNA样品的纯度比较低，存在着蛋白等杂质的污染。

而三种不同种质的甘蓝OD260/OD280用本文所述的方法进行萃取后，结果为1.792~1.905，平均为1.861，说明所萃取的甘蓝DNA具有很高的纯度。

比较纯粹的核酸，其OD260/OD230的比值要超过2.0。如果该比值低于2.0，则表示样本被糖类等污染了。

而用控制方法提取时，五种材料DNA样本液的OD260/OD230的值在0.934~1.721之间，平均值为1.375，显著低于2.0，这说明所提DNA样已经被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染了。

采用本文所述的方式进行萃取后，各样本的DNA样本液OD260/OD230比值在2.0以上，平均为2.176比值，说明所萃取的DNA样本液未受到糖类和盐类的影响。

在基因组DNA样品的浓度方面，以该实验的方式进行提取时，从甘蓝型油菜中得到的DNA样品的含量为1130ug/mL。

从芥菜型油菜中得到的DNA样品含量为975ug/mL，而从大白菜中得到的DNA样品含量则相对较低。

五种材料的DNA样品的平均含量为814ug/mL，如果使用文献法进行提取，所有材料DNA样的平均浓度为767μg/mL，DNA样的浓度在523~1046μg/mL之间进行了改变。

从表2的结果也可以看出，从芸芥和白芥这两种油菜近缘植物干种子中分离出的DNA，浓度显著地比三大类型油菜的要低。

综合以上可以看出，利用本试验方法，可以从三大类型油菜及其近缘植物干种子中，分离提取出具有一定浓度并且纯度较高的基因组DNA样品。

DNA质量对后续实验能否成功进行至关重要。以本试验的提取方法获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，可以成功地完成（图2、图3)，并且扩增产物也可以清楚地区分出来。

利用多条引物的扩增，可以实现多态性碎片的分离。在本研究的10条随机引物中，有6条在5份基因组DNA样本中都能扩增出频带。

图2和图3仅显示了部分扩增结果。从这些结果可以看出，使用该方法提取的DNA可以胜任RAPD扩增实验。

结论

在小麦、玉米、棉花、水稻、大豆和菜心等作物上，都有将种子作为材料进行DNA提取的报告。

与此同时，油菜籽中还含有黄酮、花色素苷、香豆素、鞣质等小分子次生物质，这些物质中含有酚羟基的化合物，在氧化后会与DNA结合，导致DNA的降解。

与其它从种子中萃取DNA的方法比较，该实验的主要优势在于：（1）将萃取溶液中EDTA的含量增加至50mmol/L，从而可以防止种子中的DNA被内源性核酸酶分解，从而获得更完整的DNA。

（2）以籽粒与CTAB萃取物的质量-容积比为宜，既可减少多糖对DNA萃取的影响，又可形成CTAB-核酸复合物，不易使所得DNA发生分解。

（3）将萃取物中CTAB的质量分数增加至3倍，并利用高盐方法对DNA进行酒精沉析，将多糖保持在水里，将多糖从籽粒中分离出来，达到2.0<OD260/OD230<2.5的目的，得到不含多糖的DNA样本。

（4）在萃取溶液中添加1%二硫苏糖醇、2%聚乙二醇，既能阻止多酚的氧化，又能阻止多酚与DNA的结合，使DNA的完整性得到充分的保障。

（5）采用氯仿-异戊醇溶液分别提取两次上清，再用酒精预冷却，使上清中DNA二次沉淀，可高效地去除储藏在种子中的蛋白，使蛋白的杂质减少到最小程度。

（6）采用油菜和它的近缘种的干燥的籽粒作为原料，与目前常见的采用叶子作为原料的方法比较，不但简便快捷，而且免去了幼苗培育的程序，而且极大地提高了工作效率，而且还能减少试验费用。

（7）将样品放入适当的萃取物中进行研磨，无需在液氮中进行冰冻处理，同时也可以阻止DNA的分解，从而可以避免因液氮而造成的伤害。

以上研究表明，所研究的技术手段简单实用，易于实现，可实现高纯度和高完整性的全基因组DNA的高效、高纯度的全基因组DNA的高效制备，对于研究和分析甘蓝种质资源、种子纯度鉴定以及种子形成的分子机制都有着十分重要的意义。

参考文献：

［1］许殊《一种适合MSAP分析谷物干种子的DNA提取方法》

［2］王惠，郭峰，关超，等《适用于SSR分析的半粒水稻干种子DNA快速提取》［3］匡猛，杨伟华，许红霞，等《单粒棉花种子DNA快速提取方法》

［4］刘峰，赵佩，徐子初，等《一种适用于SSR-PCR的棉花干种子DNA快速简便提取方法》