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长期以来，世界各地的科研人员都致力于以最方便、最快捷、最精准、低投入的方法来获取不含外源基因、无筛选标记的转基因植物新品系。CRISPR–Cas9 系统的出现为创建理想的突变体材料打开了一扇大门，这也是相关技术及体系在短时间内得到大力发展的最直接证据。

目前大多数报道所涉及到的相关技术都需要将携带有Cas9-guideRNA (gRNA) 以及转基因筛选标记的表达元件通过基因枪或者农杆菌介导的方式导入到受体植物材料中，并整合到其基因组上，这极大增加了脱靶的可能性【1】，同时也需要更长的时间、更多的人力及物力投入才能从目标株系的后代中分离DNA-及marker-free的候选材料。而由于外源基因的插入，对品种的审定与推广带来诸多限制【2】。因此，建立全程DNA-free的植物基因组编辑系统对于推动基因编辑作物的商业化利用具有重要意义。

将预先组装好的Cas9–sgRNA的RNPs（核糖核蛋白）复合体通过PEG–Ca2+介导的方式导入到植物的原生质体中，或者利用基因枪导入到植物的胚中可获得DNA-free的转基因材料【3】。然而，很多作物的原生质体的分离与培养体系还不够方便或者完善，而利用基因枪轰击植物胚的方法获取经过基因编辑的目的材料的效率也还有待提高【3】。近日，来自日本理化研究所（RIKEN）的Erika Toda等人提出了一种更高效的策略：将预先组装好的Cas9–sgRNA复合物导入到水稻体外受精的合子胚中，从通过组织培养再生的T0代植株中即可筛选获得全程DNA-free的经过基因编辑的目的植株，获得理想株系的效率在14-64%之间。相关成果以An efficient DNA- and selectable-marker-free genome-editing system using zygotes in rice 为题发表在Nature Plants上。

与前述利用原生质体或者胚为转化受体不同的是，该技术以体外受精的合子为受体，在被子植物中为首次报道。该课题组前期已经建立起了水稻受精和PEG–Ca2+介导的合子转化体系【4,5】，因此实施起来相对容易。其简要步骤（图1）为：

1.分别获得植物的精细胞和卵细胞；

2.利用电融合的方式使之完成受精作用；

3.融合1小时内完成Cas9-sgRNA的复合物的转染；

4.组培再生获得植株，进行突变位点的鉴定。

图1. 利用体外受精的合子进行全程DNA-free基因编辑的流程图

为验证该技术的可行性及效率，研究人员分别以外源导入的报告基因DsRed2,内源的DROOPING LEAF (DL), GRAIN WIDTH 7 (GW7), GENERATIVE CELLSPECIFIC-1 (GCS1), Pseudo-Response Regulator 37 (PRR37)为目标基因进行编辑。结果显示，在再生植株的当代都获得纯合的DNA-free的突变体植株，效率在不同靶点或者基因间存在一定的差异（图2），同时也表明可一次性对多个位点进行编辑。此外，如果将预组装的Cas9-sgRNA复合物更换为相应的质粒，那么就有外源基因整合到植株基因组上的风险。

图2. 利用该技术对多个靶基因分别进行基因编辑的效率

鉴于可通过电融合的方式在体外获得玉米及小麦的合子【6、7】，因此扩展了该技术的适用植物种类。由于该体系对体外受精操作技能的要求较高，研究人员提出可用细胞壁酶预处理自然受精后的合子，再用PEG–Ca2+将Cas9-sgRNA复合物导入其中，可很大程度上规避技术上的障碍，且其适用物种将得到进一步扩展。

参考文献：

【1】 Lawrenson, T. et al. Induction of targeted, heritable mutations in barley and Brassica oleracea using RNA-guided Cas9 nuclease. Genome Biol. 16, 258 (2015).

【2】 Jones, H. D. Regulatory uncertainty over genome editing. Nat. Plants 1, 14011 (2015).

【3】王福军、赵开军，基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战。《中国农业科学》，51，1-16 (2018).

【4】 Koiso, N., Toda, E., Ichikawa, M., Kato, N. & Okamoto, T. Development of gene expression system in egg cells and zygotes isolated from rice and maize. Plant Direct 1, e00010 (2017).

【5】 Uchiumi, T., Uemura, I. & Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta 226, 581–589 (2007)

【6】 Kranz, E. &Lörz, H. In vitro fertilization with isolated, single gametes results in zygotic embryogenesis and fertile maize plants. Plant Cell 5, 739–746 (1993).

【7】 Kovács, M., Barnabás, B. & Kranz, E. Electro-fused isolated wheat (Triticum aestivumL.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15, 178–180 (1995).

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转载来源： BioArt植物

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