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重要更正

本侠在第十一讲，也就是免疫组化第一讲里，介绍免疫组化步骤时，将“抗原修复”步骤说成了“蛋白复性”步骤，请大家宽容本侠笔误。脑子里东西太多，本侠遏制不住它们有时候自己往外蹦，嘻嘻嘻嘻。

上一讲我们把切片说完了，记性好的小伙伴可能记得在免疫组化第一讲（第十一讲）里本侠说过，完成免疫组化需要7步，现在我们说了第一步和第三步（第二步是石蜡包埋，本侠没说，因为不会，但是可以找公司完成），还剩下四个步骤，这四个步骤我们统称为“染色”

“染色”包括固定标本的抗原修复（未固定冰冻标本不需要修复操作，这里请参考一下本侠自从写blog以来首次发表的“重要说明”，在文末）、封闭、抗体孵育、显色。其实在抗原修复之前还有两个步骤，是免疫组化特有的，因为是小动作同时又为了衔接之前Western的思维（如果不同方法从原理和操作上归纳得比较相似，就比较利于理解和掌握），本侠就没有写，这两个步骤分别是：细胞通透（这个词从字面上看，它所表达的意思可是一点也不通透啊，等会儿跟大家解释）和灭活内源性过氧化物酶。这两个步骤存在的原因也是之前我们提到的，免疫组化的样本比较原汁原味，细胞可能是完整的（只要没有被刀片从中间劈开），所以它就比Western所用的经过提炼和处理的蛋白样本复杂的多，需要面对的因素也要多得多。

如果是做石蜡切片，在做抗原修复之前，还得再有一个额外的步骤，就是脱蜡。因为样本是被埋在石蜡里面的，如果带着石蜡一起做染色，妥妥的是染不出来的，所以首先要把石蜡去除，这个步骤就叫做“脱蜡”。脱蜡用的试剂是“二甲苯”，因为石蜡能溶于二甲苯（两者极性都很小，学过有机化学的小伙伴们一定听过“相似相溶原理”）。但是固态的石蜡不易溶于二甲苯，所以在用二甲苯脱蜡之前，需要将切片放至60℃烘箱烤上45min（请参见小贴士1），待石蜡出现肉眼可见的融化，迅速将切片浸到二甲苯中，为了确保石蜡被溶解干净，二甲苯溶解石蜡的操作一般做两遍。二甲苯处理完成，我们肯定不能把粘着二甲苯的切片拿去染色，得先把二甲苯洗掉，但是刚刚提到过，二甲苯极性很小，我们不可能用PBS或者水把它洗干净（因为水的极性很大），然而对于做染色来说，系统里对染色影响最小的溶液也就是PBS或水了，怎么才能把切片最后用PBS或者水来清洗呢？我们只能再次利用“相似相溶原理”一点点提升溶液的极性。我们先用纯的酒精来洗掉二甲苯，再用酒精和水的混合物（也就是高浓度或低浓度酒精）来不断稀释纯的酒精以及残留的二甲苯，最后用水来洗掉酒精，搞定！而且最后用水来洗片还可以达到所谓“水化”的效果，本侠没查到能说服自己的原理，据说对染色很好，额……好吧。不过每次遇到这类操作，我都不禁感叹，究竟是什么样的大神，上通天文、下知地理，才能想到这样的方法，五体投地！

脱蜡步骤

首先把切片放到染色架上（可以放多张片子），然后用绳子把染色架拴起来方便拿来拿去，尤其是放进染色缸的时候就太方便了。接着把染色架（当然上面有切片啦）放进烘箱让石蜡融化，然后拎着染色架放进盛有二甲苯的染色缸，静置15min，下面的流程是：二甲苯（另一个缸）15min；100%酒精2min；90%酒精2min；80%酒精2min；70%酒精2min；蒸馏水2min；蒸馏水（另一个缸）2min。这一套过程下来，脱蜡完成！所以这就意味着，你要准备8个大染色缸（下图中不带卡槽的那种），分别装上上述流程的液体，液体的量需要至少能淹没所有切片。

通透&灭活

为了保证在染色过程中试剂充分进入细胞，脱蜡完成后需要对细胞进行通透操作，说白了就是在细胞上打洞。打洞的试剂常用的有TritonX-100和蛋白酶k（常用浓度网上都有）。从这里开始，染色步骤开始出现一些精致操作：由于切片很小，加上某些试剂很昂贵（比如抗体），所以我们希望尽量少用点试剂。于是就出现了直接把试剂点在切片上的做法（而不是像脱蜡那样用上几百毫升液体浸泡切片），这样也许只需100微升试剂就足够了。但是液体在玻片上不一定能固定边缘，很可能会淌走，所以就需要把试剂“圈”在组织周围，于是一个用于画“圈”的神笔就诞生了（请见下图）。

不用本侠提示，小伙伴们也能猜到，这样一支笔肯定很贵。奈何天无绝人之路，不想花重金买这支笔的，用指甲油也可以哟，不要怪我没提醒你指甲油也有高低档次，但效果没差。细胞通透完，再把切片放入用PBS配制的3%H2O2中浸泡15min（这时用的染色缸可以是没有卡槽的大缸，也可以用有卡槽的小缸，如果用有卡槽的，需要把载玻片一张张插进去），以灭活内源性过氧化物酶（请参见小贴士2）。这么做的原因是抗体孵育时用的二抗通常是HRP（辣根过氧化物酶）标记的（当然也有其它酶标记的，比如碱性磷酸酶标记，看你买哪种了。但请注意，标记不同，显色底物也要相应更换），显色的时候我们会用过氧化物酶的底物与HRP反应，如果样本本身也含有过氧化物酶的话，那么底物也会与样本中的过氧化物酶反应，造成假阳性，所以我们需要事先用H2O2把样本中自带的过氧化物酶灭活。

抗原修复

接下来的步骤就是期待已久的甲醛或多聚甲醛固定样本所需要做的“抗原修复”（请参见小贴士3）。比较常用的修复方法是热修复，有些地方也叫高温修复，还有的地方叫做微波修复，做法也很简单，先把修复液（关于修复液，请参见小贴士4）放进微波炉，高火5min让修复液沸腾，然后把切片放到修复液里，再放进微波炉，中火10-15min进行修复，最后自然冷却（约20min）即可。但是有些抗体是有特殊要求的，比如需要进行酶修复，那么就必须按照抗体说明书来。所以进行抗原修复之前，请先仔细阅读抗体说明书，如果说明书没有说明，可以尝试用热修复。修复完就是我们熟悉的封闭过程了，用PBS配制5%的BSA，点到样本上，37℃（室温也行）孵育1h就可以了。封闭液的浓度可以自己根据需要调整，但是本侠建议大家不要提高到10%，会比较粘稠，效果没觉得有多好，但是却很难洗掉。一抗和二抗的孵育，与Western类似，不同的是，稀释好的抗体也是点在切片上的，体积很少。抗体都可以用1%BSA稀释，也有实验室直接用PBS稀释抗体，都行吧。一抗孵育先用4℃过夜，然后37℃再孵育1h（请参见小贴士5），二抗用37℃，1h即可。染色过程中所有的洗涤步骤都在有卡槽的染色缸进行，将载玻片插入染色缸，倒入PBS，放在摇床上洗涤。

显色

最后还有一步就是显色，这一步也很简单，买一个市售的DAB试剂盒（如果二抗是HRP标记的话，如果不是HRP，那就什么酶买什么底物），按照说明书操作即可。染完我们想要染的目的蛋白，一般我们还会再复染一下苏木素，这样可以把细胞识别出来，目的是防止染出来的目的蛋白不在细胞上，是个假阳性结果。苏木素复染同样很简单，买来后直接滴在染好目的蛋白的切片上，等1-2min，用水冲洗多余的染液就行了。所有操作做完以后，如果标本想长期保存，需要进行封片，常用的封片剂是中性树胶，本侠封片不专业，就是等染色标本风干后，直接将中性树胶点在样本上加盖玻片，好像也没什么问题。但是有些显色液不适合用中性树胶封片，比如需要用水溶性的封片剂，那么小伙伴们需要根据底物要求选择合适的封片剂。

到这里为止，免疫组化所有的步骤就介绍完了，本侠对于免疫组化知之甚少，不足之处，忘指正，茫茫学海，大家共同进步！最后防止小伙伴们被本侠说的凌乱了，附上一张流程图，祝组化路上顺利尔！

猪猪侠小贴士

1、 60℃烤片的时间不一定严格45min，因为每个人选择切片的厚度不一样，需要加热的时间肯定也不同，时间长短选择的依据是石蜡开始融化成小液珠状但切片又不掉。烘箱的温度倒是需要比较注意一下，温度低了石蜡不容易化，温度高了又容易化过头。控制烘箱的温度本侠喜欢用温度计自己调整，因为每家烘箱的温度传感器灵敏度不一定相同，控制出来的温度肯定有差异，所以对于做实验的质控不利。

2、这里有一个饱受争议但却无结论的问题，就是究竟应该先灭活内源性过氧化物酶还是先进性抗原修复。业内两种做法都有，如果有小伙伴不放心，先灭活再修复，修复完了再灭活一次也不是不可以，简直了。

3、修复的方法本侠只介绍了自己用过的两种，一种是热修复，一种是酶修复。市面上还有高压修复，具体怎么做本侠就不清楚了，据说效果比较猛烈。

4、热修复的修复液其实是比较常规的试剂，常见的是枸橼酸钠修复液（又叫柠檬酸钠修复液），配方也是大同小异，大家可以度娘，本侠也给大家提供一个配方，小伙伴们自便：0.01M枸橼酸钠（柠檬酸钠）缓冲液：称取柠檬酸0.4g、柠檬酸三钠3g，用800ml H2O溶解后定容至1000ml，此时PH值应为6.0左右，如果不是6.0，就需要调整PH值，但是很不好意思，本侠忘了拿什么调了，如果酸了应该可以用氢氧化钠，因为不会引入新的离子，但如果碱了好像只能用柠檬酸调了，用别的酸就引入新的离子了，只能帮你到这里了，对不住啊，哈哈。对了，说到PH值，用来洗涤的PBS据说PH值需要控制在7.4-7.6，不然结果会有惊无喜。

5、有很多小伙伴担心抗体是不是能结合在蛋白上，这里本侠很负责任地告诉大家，如果排除脱蜡、修复、通透等操作不当，同时排除抗体太差劲，那么抗体即使在4℃，也会很快结合在蛋白上。有一次本侠操作失误，把一抗加到样本上放4℃半个小时后发现不该加这个抗体，于是洗了，但是最后发现还是染出来了，多尴尬。

对第十一讲（也就是免疫组化第一讲）中“未固定冰冻切片”的重要说明：

本侠说过如果做冰冻切片的话，取下来的组织是可以不用固定直接切片的，但是切完片以后在染色前还是要固定一下的，这样切片不易脱落且据说固定后的切片也可放到-80℃长期保存（这样一来本侠第十一讲说的不固定的冰冻样本必须马上做完组化似乎就不对了，对不住大家。但是由于丙酮固定后长期保存本侠没试过，所以效果也不敢保证啊，小伙伴们看着办吧，呵呵哒）。固定液是“负二十度预冷过的丙酮，纯的丙酮”。冰冻切片完成以后，把切片放室温静置晾干，然后把预冷的丙酮加到切片上5-10min即可。由于丙酮不影响蛋白质结构，所以固定后的样本不用进行抗原修复。

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