文字/编辑 史记泛舟

前言

通过筛选根际细菌，发现了有效抑制植物病原体和促进植物生长的物种。基因组测序是获得生物技术应用微生物完整特征的关键步骤。

本研究旨在对四种根际细菌的基因组进行测序，这四种根际细菌对四种根部病原体的抑制作用以及与辣椒根部的相互作用不同，以鉴定物种并分析抗生素代谢物生物合成基因簇（BGC）的差异，并确定可能的表型-基因型相关性。

velezensis基因组中的 13 个 BGC2A-2B 中不存在于其他细菌中的现象可以解释其有效的抗真菌能力，也可能有助于其与辣椒根的友好相互作用。四种细菌共有的大量非核糖体肽和聚酮化合物的其他 BGC 对表型差异的贡献要小得多。

一、材料和方法

将每种细菌菌株和病原真菌（茄镰孢、尖孢镰刀菌、茄红霉）或卵菌（辣椒疫霉）在体外培养板上用 PDA、TSA 或 KB 培养基进行对抗。

将每种细菌菌株接种在装有培养基的平板上的4个等距点上，在28℃下培养2天，立即在距菌落边缘4毫米处形成新鲜生长（5天龄）的P.将辣椒或 3 种真菌的 2 天培养物置于每个板的中央，距细菌生长点 5 厘米，并用n值为12。

对于植物-细菌相互作用测试，将体外培养的 12 天大的 Mirasol 品种辣椒幼苗从根部浸入光密度为 610 的细菌悬浮液中 10 分钟。nm调整为0.1，细菌先前在LB培养基中生长24小时。

立即将植物转移到含有50% MS培养基的平板上，一半平板不含MS培养基，并垂直放置；植物的根固定在MS培养基上，而叶子的中上部没有培养基。将平板上的植物置于生物气候室中，光照周期为 14 小时，温度为 27°C。包括未接种细菌的对照植物。

每个处理一式四份进行，并且每个植物被认为是重复。组织坏死和枯萎的叶子（患病植物）或健康的根和植物（无症状）的演变记录为 10天。疾病症状除了叶子枯萎外，还表现为茎基部或根部整个长度迅速扩大的深棕色病斑。

二、结果和讨论

菌株 2A-2B 在培养皿中的三种培养基（蛋白胨-葡萄糖琼脂 [PDA]、胰蛋白酶大豆琼脂 [TSA] 和 King B [KB]）中进行双重对抗，显示出 68% 至 81% 的生长抑制辣椒中的真菌病原体镰刀菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌以及卵菌病原体辣椒疫霉的强毒菌株。细菌菌株2A-2A和3A-25AI，对病原体的体外生长有中等水平的抑制（43%至61%）；而 MS50-16 仅抑制 1% 至 3% 的病原体生长。

关于植物-细菌相互作用，在接种后 6 天的体外测试中，当接种到培养皿中 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基中培养的辣椒幼苗根部时，2A-2B 和 MS50-16 表现出无害（友好）。盆栽植物根部接种具有类似的行为（数据未显示）。

相反，2A-2A和3A-25AI接种于辣椒幼苗根部时表现出敌意行为并引起坏死，疾病严重指数（DSI）为3.7（4级），与对照相比差异有统计学意义（ P < 0.05）。

在盆栽条件下和生物气候室中，用 2A-2B 细菌在辣椒植物的根部预接种可提供针对病原体 P. capsici和R. solani侵袭的保护作用。预接种细菌后接种病原体的植株在接种后 4 d 时发病指数为 0.6，而未预接种细菌后接种病原体的植株发病指数在 4 级上升高至 3.8，差异有统计学意义（ P < 0.05 ）。

在使用 SPAdes 软件 ( 10 )进行的组装中，获得了具有可变大小的部分测序基因组（草稿）。MS50-16 的基因组是最小的菌株，长度为 3.43 MB，有 3,164 个基因，N 50为 136。2A-2B 的基因组大小中等，为 3.96 MB，包含 3,962 个基因，N 50为 64最大的基因组是2A-2A和3A-25AI，分别为5.64和5.60 MB；2A-2A和3A-25AI具有5,056和5,490个基因，N 50值分别为190和100。

2A-2B的基因组的GC含量百分比为46％，MS-5016的基因组为65.5％，2A-2A和3A-25AI的基因组为45.5％(表1 )。NCBI GenBank 中的基因组比对用于阐明所研究菌株所属细菌种类的覆盖范围和身份。

多粘菌2A-2A 和 3A-25AI的基因组之间的比对表明，这些菌株之间存在非常高水平的同一性，在大部分有义链 DNA 中具有广泛的比对区域，而在反义链中则较少。这两个基因组之间的平均同一性为 99.96%，尽管也存在大量断点、易位、插入和少量重定位（数据未显示）。

两个基因组之间的保守区域覆盖了B. velezensis 2A-2B的整个延伸，没有一个区域缺乏同源性。在2A-2B的基因组中，至少发现12个LCB处于相同方向，并且发现11个LCB处于相对于参考基因组的反向互补(反向)方向。

2A-2B 基因组中的倒转区域是该菌株的一个显着特征，因为在多重比对中，2A-2B 的其他三个基因组具有最高同一性的B. velezensis包括JS25R、AD8和GFP-2，这些重排仅在2A-2B中观察到。

对于多粘 P. 多粘菌2A-2A，antiSMASH 分析表明，基因组中有 25 个区域包含 BGC，如下所示：与已知簇具有高度相似性（90% 至 100%），与 Paenilan、anabaenopeptin NZ857/nostamide A 相关的区域，杀青霉素A、杀镰刀菌素B、十三霉素和普粘菌素。

与已知基因的相似度较低（14% 至 46%），这些基因与 marthiapeptide A、bacillaene、bacilomycin D、S 层聚糖、nosperin 和 pyxipyrrolone A/pyxipyrrolone B 相关；12个BGC与GenBank中已知的簇没有相似性。具有 BGC 的 25 个区域大小为 815 kb，占基因组的 14.4%。

对于多粘假单胞菌3A-25AI 基因组，抗 SMASH 分析显示与 2A-2A 的基因组略有不同。有24个区域具有BGC，如下：5个与已知BGC表现出高度相似性，其中有镰刀菌素B、类青霉素A、paenilan、多粘菌素和sevadicin；相似性较低（16% 至 54%）的 BGC 面向青霉素、马硫肽 A、卡林他星 A ( 2 )、pelgipeptin、S 层聚糖和 swinholide Ax 的生物合成。具有 BGC 的 24 个区域共 4.35 kb，占 3A-25AI 基因组的 5.7%。

两种多粘菌菌株基因组中保守的用于生物合成抗生素代谢物的基因簇包括用于生物合成呋喃西丁 B（在两种菌株中保守，具有 100% 相似性）、类青霉素 A（在 2A-2A 和 2A-2A 中保守，具有 100% 和 85% 相似性）的 BGC。

分别为 3A-25AI）、paenilan（与两种菌株中的已知 BGC 100% 相似性）、多粘菌素（与两种菌株中的已知 BGC 100% 相似性）、paenibacillin（2A-2A 中的一个 BGC 和 3A-25AI 中的 2 个 BGC； 3A-25AI 与已知的 BGC 相似度较低）、marthiapeptide A 和 S 层聚糖。

相反，两种P. polymyxa基因组之间的 BGC 存在差异这些菌株是参与 bacillaene、bacillomicin D、anabaenopeptin NZ857/nostamine A、nosperin、tridecaptin 和 pyxipyrrolone A/pyxipyrrolone B（在 2A-2A 一侧发现）和 sevadicin、kalimantacin A、pelgipeptin 生物合成的 BGC， swinholide 和其他未知的物质，在 3A-25AI 的侧面发现。

然而，B. velezensis 2A-2B 在抗生素类代谢物生物合成的保守基因簇中表现出显着差异，其中与 P. polymyxa 2A-2A 和 3A-25AI 没有观察到一致，除了一个 bacillaene 的 BGC 外生物合成，仅与 2A-2A 共享。

对于 MS50-16 基因组，antiSMASH 分析仅显示 7 个具有 BGC 的区域，这是与已知 BGC 相似性较低的 6 个基因簇，用于去铁胺、类胡萝卜素、窄菌素、杆菌肽、SF2575 和微安沙霉素的生物合成，所有这些基因都与已知的 BGC 相似。已知 BGC 介于 4% 至 50% 之间，以及与已知 BGC 没有相似性的 T3PKS 型基因簇。这七个具有 BGC 的区域占据了 145 kb，占基因组的 4.2%。

2A-2B基因组的特征在于具有三个用于风霉素的BGC和三个用于表面活性素抗生素的BGC，如下：一个用于风霉素的BGC与MIBiG数据库中已知的用于风霉素的BGC具有高度相似性(80%)，另外两个具有相似性20% 至 26% 之间。

对于表面活性素的其他三个 BGC，相似性在 8% 到 47% 之间。在2A-2B中，发现用于风霉素生物合成的三个BGC分别跨越87.4-、12.8-和9.4-kb区域。最长的包含一个候选簇和一个包含约 32 个核心基因的原簇。在第二次BGC中，识别出候选簇、原始簇、原始核心簇；还有3个核心基因和超过25个次要基因。在2A-2B中较小的BGC中，发现整个区域都识别出候选簇、原始核心簇和原始簇，以及两个核心基因和20多个具有NRPS结构域的基因。

在2A-2A基因组中，鉴定出38个用于次生代谢物生物合成的基因簇。在这些BGC中，合成的次级代谢物对应于26种非核糖体肽、四种聚酮化合物、四种I类羊毛肽、一种套索肽、一种杆菌溶素、一种II/III类可信细菌素和一种未知的硫模板化簇类型。

在3A-25AI基因组中，鉴定出30个基因簇，在这些BGC中，合成的次级代谢产物对应于21种非核糖体肽、4种聚酮化合物、4种I类羊毛肽和1种套索肽。在MS50-16基因组中鉴定出两个基因簇，一种不依赖于NRPS的铁载体合酶和一种聚酮化合物，后者与其他两种细菌菌株共享。

三、结论

在此研究的四种细菌中，菌株 2A-2B 作为生物防治剂在阻止辣椒作物的根部病原体方面表现突出，并且与植物根部具有友好的相互作用。在这四种根际细菌的基因组测序中，我们确定2A-2A和3A-25AI均属于P.polymyxa，它们之间的基因组相似性较高，MS50-16的同一性较低，是K.polaris菌株，2A-2B是K.polaris菌株，经证实为贝莱森巴氏杆菌(B. velezensis)菌株。

B. velezensis 2A-2B在整个基因组中具有保守区域，与参考基因组相比没有缺乏同源性的区域，但与同一物种的三个参考基因组相比观察到不同的进化轨迹。

2A-2B 中的 Surfactin（三个 BGC）有助于与植物的友好相互作用，因为除了增强植物对病原体的防御之外，其在生物膜形成、运动和根部定植方面的相关功能已被报道。因此，B. velezensis2A-2B对于辣椒和其他蔬菜作物的根部病原体的生物防治具有很高的潜力。需要进一步的基因组测序分析，以更深入地了解与抑制植物病原体以及与植物相互作用相关的遗传特征。

参考文献：

【1】Passera A、Vacchini V、Cocetta G、Shahzad GI、Arpanahi AA、Casati P、Ferrante A、Piazza L. ，《走向营养敏感型农业：细菌接种剂的生物防治效果、营养价值和生态影响的评估》

【2】Chen R、Wong HL、Kindler GS、MacLeod FI、Benaud N、Ferrari BC、Burns BP，《在鲨鱼湾微生物垫中发现丰富的生物合成基因簇》

【3】Rangel LI、Henkels MD、Shaffer BT、Walker FL、Davis EW、II、Stockwell VO、Bruck D、Taylor BJ、Loper JE，《代表荧光假单胞菌四个亚类的细菌的毒素复合物基因簇和昆虫毒性的表征》

【4】Wang H, Fewer DP, Holm L, Rouhiainen L, Sivonen K. ，《非核糖体肽和聚酮化合物生物合成途径图谱揭示了非模块化酶的常见现象》