文/农人贾老师

编辑/农人贾老师

介绍

莲花广泛生长在南亚，是佛教的象征。其花蕾作为切花用于装饰(图1A，B)。

图1

尽管它们在市场上很重要，但莲花花瓣在切割后不久就会从边缘变成黑色。花瓣变黑伴随着衰老和花瓶寿命缩短，降低了切花在市场上的价值。

一种植物激素乙烯与莲花的衰老有关。乙烯利(乙烯的一种来源)的处理加速了花瓣变黑，而1-MCP(乙烯受体的抑制剂)延缓了切花的衰老并延长了花瓶的寿命。

花瓣变黑和开花不足与收获后的水分稀薄和碳水化合物有关，同时伴随着乙烯产量的增加。

对另一个莲花品种花瓣细胞变黑过程中的解剖和超微结构分析表明，变黑伴随着细胞的退化，包括细胞塌陷、细胞质中物质沉淀和原生质收缩。

这种细胞形态对了解花瓣变黑的生理过程具有重要意义。

莲属植物的栽培品种根据其形态特征进行了分类，包括花、叶、植株和根茎的大小和生长特征。

然而，形态特征通常很难区分，因为它们可能由于品种内的变异或环境影响而改变。

与其他DNA标记相比，SSR标记具有较高的多态性、共显性遗传和真核生物基因组丰度等优点。

迄今为止，尚没有对泰国品种的SSR分类进行研究。因此，这些标记在分子水平上对商品品种进行分类是有用的。

对泰国两个主要莲品种的系统发育关系和形态进行了研究。它们在基因上是分开的，花瓣变黑的时间也不同。

这里发现的形态特征可用于选择或鉴定花瓶寿命较长的优良品种。

材料与方法

2.1植物材料

收集嫩叶并保持湿润，直到提取每个品种的DNA，收集并检查了开花前第5期的花蕾，直径为6.0 - 6.5 cm 。

收获后，茎在水中切至25厘米长，置于室温下的房间中300毫升蒸馏水中。

图1

2.2用简单序列重复标记进行系统发育分析

使用荧光仪和3%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。

用于系统发育分析的25个SSR标记分别为：NSh02、NS001R、NS012、NS020、NS034、NS049、NS077、NS080、NS092、NS124、NS139、NS149、NS160、NS169、NS219、NS224、NS227、NS262、NS292、NS294、NSe01、NSe03、Nel06、Nel14和PR09。

对每对SSR引物进行PCR扩增，每对引物均进行荧光标记。PCR条件为：94℃初始变性1分钟，94℃ 30次循环30秒，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，72℃最终延长5分钟。

图2

之后，使用CEQ8000测序仪用于确定片段大小和多态性评分。利用人口模型生成了一棵邻居连接树进行BS分析，共1000次重复。

2.3花瓣变黑的形态学分析

涂黑剪花的花瓣，味蕾在量筒检查6小时。每个量筒的环境温度(28±1℃)，80 - 85%相对湿度和自然光(光从约600小时 - 1800小时)。

变黑的程度定义为一个百分比(10%=出现花瓣变黑、25%=黑补丁在花瓣的边缘，50%=整个边缘被涂黑，75%=整个花瓣黑涂黑区域扩张和100%=整片花瓣变黑)。

图3

为了进行细胞分析，将50%黑色斑块的花瓣固定在1:9的醋酸：乙醇溶液中1小时，每一步在乙醇系列(90、70、50和30%)中水合20分钟，并在澄清液(10 g水合氯醛、2.5mL甘油和1.25mL蒸馏水)中浸泡过夜。

使用光学显微镜BX43对表皮细胞进行成像，并使用Image J软件测量表皮细胞的面积和周长。

根据花瓣的面积来计算气孔的数量。数据分析采用Microsoft Excel 2010通用线性模型程序。

2.4结果两个品种简单序列重复序列的多态性

为了明确两个主要莲品种的系统发育关系，利用25个SSR标记对其基因型进行了检测。

图4

最初，使用两个标记NS139和NS292进行扩增，以检查提取DNA的质量，分别产生预期大小的150bp和100bp扩增子。

这些DNA被确认适合后续分析。这25个SSR标记被用于98个莲瓜品种的成功分类。

图3为NS124、NS139和NS034标记的片段分析示例。在标记NS124和NS139中，Sad和Sat之间没有多态性(见图5上表的黑色轮廓)，而Sat与其他品种表现出不同的条带模式(图4上表)。

图5

在25个标记中，仅在NS034中观察到Sad和Sat之间存在多态性。

这些结果反映了不同品种间不同的多态性模式。根据等位基因数据计算了两个品种的遗传距离，并用NJ方法构建了系统发育树。

结果表明，品种Sad与高BS值(96%)的Sat属于同一组，品种Sat与高BS值(90%)的Sad关系密切。研究结果与之前发表的系统发育树进行了整合。

Sad与Sat属于同一组，Sat是在日本种植和采集的，这支持了Sat来自泰国的描述。

图6

Sat被归为同一亚群，但BS值相对较低(图4)。budda -hasu与它们属于同一进化支，这表明它也来自东南亚。

品种Sat和sad的衰老和花瓣变黑

将Sat和Sad的切花芽置于蒸馏水中，花瓣迅速变黑(图6)。两个品种的花瓣在6小时后出现第一次变黑迹象。

Sat在72小时后产生50%的发黑，而Sad在54小时后产生发黑。

Sat和Sad分别在102和96小时后达到100%发黑(图6)。这些数据表明，粉红色花瓣品种Sat具有较长的花瓶寿命。

2.5花瓣变黑时的细胞形态

研究了沙达蓬果和沙达布特拉两个品种花瓣变黑过程中细胞形态的变化。正常花瓣表皮细胞可见新鲜和圆的形状肿胀细胞(图7 A)。

图7

两个品种的正常组织中都有膨胀的气孔，尤其是保卫细胞。花萼变黑的形态发生在组织衰老过程中。

花瓣变黑的原因是组织排列不完整，细胞的大小比正常花瓣小。所有细胞周围可见棕色区，这导致花瓣收缩和颜色变深。

2.6细胞定量

利用Image J软件对细胞尺寸测量、细胞面积和周长进行了研究。两个品种的表皮细胞在面积和周长上的缩小幅度都小于正常细胞。

两个品种正常花瓣的面积和周长都明显大于变黑花瓣(图8B)。正常细胞的面积和周长明显大于变黑细胞。

图8

由于水分与花瓣变黑有关，因此对两个品种的气孔数都进行了统计，Sat的气孔数量少于Sad(图8)。

结果与讨论

利用基因组序列和EST序列构建的SSR标记对两种莲品种进行了分类。此前，有人开发了35种标记物，而其他研究人员开发了26种标记物。

本研究对25个SSR标记进行了测试，以确定哪些SSR标记可以作为PCR标记，其中一些SSR标记也是类似大小的扩增产物。

观察到的多态性可用于近缘莲品种的分析，花瓣性状与遗传关系之间没有很强的整体相关性。

因此，了解具有不同花形态(花瓣颜色)和采后寿命的品种是否存在遗传关系将会有所帮助。

系统发育分析表明，Sad与Sat亲缘关系较近。它们的花有50多个白色花瓣，表明Sat与Sad基本相同。

据记载，Sat是2011年从泰国传入日本的，在传递过程中出现发音错误。

如果能在同一地点同时对这些密切相关的品种进行采后生理的直接比较，可能会很有趣。

花瓣呈粉红色的Sat被归为另一个亚群，但其BS值为90%，表明莲蓬属植物的遗传多样性相对狭窄。

两个品种不仅在遗传上存在差异，切花采后品质也存在差异。一般来说，切花的衰老会导致蛋白质、脂质和核酸的降解。这一过程导致细胞程序性死亡。

两个品种的花瓣发黑时间不同，白色品种发黑时间早于粉红色品种。这可能表明，由于花青素，粉红色可以防止变黑。

花瓣变黑是由多酚氧化酶(一种积累在细胞质中的酚类化合物)的氧化和原生质的收缩引起的，不同花瓣品种花瓣变黑的研究。

Sat正常花瓣(A)并伴有花瓣变黑症状(B)，Sad正常花瓣(C)并伴有花瓣变黑症状(D)，衰老过程中表皮细胞的解剖变化需要不同颜色的花瓣来证实这个假设。

另一种可能与气孔的数量有关。Sat气孔较少，花瓶寿命较长，表明水分流失率较低。

由于温度、相对湿度和氧气等外部环境因素均可引起花瓣变黑，因此，花瓣颜色和表皮结构是沙塔蓬果品种花瓶寿命较长的原因。

尽管如此，在市场上，白色品种在泰国是首选的装饰品种。因此，需要开发延长花瓶寿命和防止花瓣发黑的方法。

据报道，Sad的外花瓣呈绿色，内花瓣呈白色，花瓣在24小时内开始变黑，花瓶寿命为23天。

对日本切花品种精卡白莲的解剖关联衰老和采后质量的研究表明，花瓣在第2天开始变黑，第7天达到50%。

精卡白莲的花瓶寿命为7.0天。

这些结果表明，花瓶寿命的差异是由于不同的遗传背景造成的，但生长条件可能是造成差异的另一个原因。

由于莲花是一种更年期植物，它的呼吸速率和乙烯产量高，导致其衰老迅速。

这就是为什么各种类型的生理应激通常伴随着乙烯产量的增加，从而影响快速衰老。

同样，在康乃馨的衰老过程中，乙烯的产量会出现更年期的增加，乙烯的进化导致花瓣卷绕和整朵花的枯萎。

综上所述，Sa与Sat属于同一组，BS值高达96%。泰国莲品种接近，BS值为90%。

采后切花在环境温度(28±1℃)蒸馏水中保存，在花瓶寿命6小时时花瓣开始发黑。

Sat和Sa的花瓶寿命分别为72小时和54小时。两个品种均表现出细胞形态变化，花瓣变黑。

参考文献

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