对于做过分子实验的小伙伴来说，传统的分子克隆技术——酶切连接大家应该都是比较熟悉的，那么对于其他的分子克隆技术类型大家有了解过吗？根据不同的实验需求，来选择不同的分子克隆技术以及产品。本期，大家和小编一起来了解下几种常规的分子克隆技术吧。

一、酶切连接

酶切连接法属于经典的分子克隆方法，利用限制性内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA，最后转化筛选及纯化，完成重组基因的大量制备。

图1 酶切连接流程

成功的酶切和有效的连接是分子克隆实验圆满完成的必要条件。限制性内切酶能特异性地结合于能被限制性内切酶识别的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性,可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。分子克隆技术中最常用的是Ⅱ型酶,切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。粘性末端，即限制性内切酶在DNA双链上交错切割，形成的核苷酸顺序互补的，可形成氢键的末端（见图2）。平齐末端，限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断（见图3）。

图2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

图3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

爱必信拥有目前常用的如快速内切酶BsaI（abs60206）、快速内切酶ClaI（abs60209）、快速内切酶EcoRI（abs60213）、快速内切酶HindIII（abs60217）等在内的四十多款限制性内切酶。

表1 爱必信限制性内切酶介绍

货号

产品名称

规格

产品特点

abs60200

快速内切酶ApaLI

200T

快速酶切

5-15min即可完成酶切；

通用的buffer

大大简化了酶切反应；

高保真

极低的星号活性；

高度冗余

轻松应对过量、复杂底物；

完美兼容

经验证所有Absin快速内切酶与其他品牌酶切体系相互兼容。

abs60201

快速内切酶AscI

50T

abs60202

快速内切酶AvrII

25T

abs60203

快速内切酶BamHI

500T

abs60204

快速内切酶BclI

125T

abs60205

快速内切酶BglII

100T

abs60206

快速内切酶BsaI

50T

abs60207

快速内切酶BstBI

100T

abs60208

快速内切酶BstEII

100T

abs60209

快速内切酶ClaI

50T

abs60210

快速内切酶DpnI

50T

abs60211

快速内切酶DpnII

50T

abs60212

快速内切酶EagI

25T

abs60213

快速内切酶EcoRI

600T

abs60214

快速内切酶EcoRV

200T

abs60215

快速内切酶Esp3I(BsmBI )

30T

abs60216

快速内切酶FspI

50T

abs60217

快速内切酶HindIII

500T

abs60218

快速内切酶HinfI

500T

abs60219

快速内切酶HpaI

50T

abs60220

快速内切酶KpnI

200T

abs60221

快速内切酶MluI

100T

abs60222

快速内切酶MnlI

50T

abs60223

快速内切酶NcoI

30T

abs60224

快速内切酶NdeI

200T

abs60225

快速内切酶NheI

30T

abs60226

快速内切酶NotI

50T

abs60227

快速内切酶NruI

50T

abs60228

快速内切酶NsiI

25T

abs60229

快速内切酶PacI

25T

abs60230

快速内切酶PstI

500T

abs60231

快速内切酶PvuII

200T

abs60232

快速内切酶SacI

100T

abs60233

快速内切酶SacII

50T

abs60234

快速内切酶SalI

200T

abs60235

快速内切酶SbfI

25T

abs60236

快速内切酶SmaI

100T

abs60237

快速内切酶SpeI

50T

abs60238

快速内切酶SphI

50T

abs60239

快速内切酶SspI

60T

abs60240

快速内切酶StuI

100T

abs60241

快速内切酶TaqI

200T

abs60242

快速内切酶XbaI

500T

abs60243

快速内切酶XhoI

500T

abs60244

内切酶SgeI

250U

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA接酶催化双链DNA子中相邻碱基的5’-P末端与3-0H间形成3’,5’-磷酸二酯键。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被称为生物界的“502”。在有Mg2+和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻，但不能催化单链DNA之间的连接。

图4 T4 DNA连接酶作用位点

二、TA克隆

TA克隆是指把PCR片段与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法重组到T-载体中，通过测序测定DNA序列。爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。

爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）产品特点：

1、阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10% 。

2、方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化。

3、T Simple载体无常用酶切位点，利于含酶切位点基因克隆。

4、无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆。

5、提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照 。

6、 蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深 。

7、批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测。

图5 TA克隆流程

三、无缝克隆

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）就是基于重组原理的无缝克隆技术，它不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）特点：

1.简单便捷：兼容PCR产物体系与载体酶切体系，省去繁琐的纯化步骤；

2.高阳性率：定向克隆单个DNA片段至载体上，阳性率高于95%；

3.快速反应：反应时间大大缩短，最快仅需5min。

4.单片段、多片段均可连接：单个或多个片段同时插入，省去重复纯化与酶切过程。

图6 爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）无缝克隆操作流程

四、TOPO克隆

TOPO克隆实际是基于拓扑异构酶的克隆技术，关键是拓扑异构酶。该技术不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。

表2 爱必信TOPO克隆产品

货号

产品名称

规格

产品特点

abs60091

T-Vector pTOPO快速克隆试剂盒

20T/100T

快捷，不需连接酶，克隆三步到位

abs60094

Blunt pTOPO快速克隆试剂盒

20T/100T

abs60095

pBM16A Toposmart快速克隆试剂盒

20T/3×20T

abs60096

pBM27 Toposmart快速克隆试剂盒

20T/3×20T

五、Geteway克隆

Geteway克隆利用位点特异重组实现目的片段的插入的，载体上的一段目的片段在重组酶的作用下会替换成目的片段，不依赖限制性内切酶和连接酶，导入目的基因不需要开环处理，载体需要用试剂盒提供的载体，一般需要用到两个载体，快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆。