前言:
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编辑|胡一舸
前言
小球藻是绿藻类植物中最早期的一种球状真核生物。迄今为止,已经报道了十多种、几百个小球藻,在全球范围内都有很大的分布。
小球藻具有极快的生长速率和极高的光合作用,它不仅能够利用光能进行自养,还能够利用有机碳源进行异养,具有非常高的营养价值;
它的油脂还可以被加工成生物柴油,因此在医药、化工、食品和生物能源等方面有着广泛的应用。
以往对小球藻的研究主要集中在形态结构、生理生化、超微结构和细胞壁组分等方面,而对其进行系统的研究较少。
小球藻个体小,种类多,性状单一,属于双球藻门和绿藻门,其系统发育关系复杂,各阶元间存在着较多的重叠和模糊的界线,这给小球藻的鉴别带来了很大困难,严重时会造成鉴别的误差。
笔者前期对小球藻的遗传多样性进行了分析,发现该属下的GC含量在真核细胞中具有广泛的分布,这说明现有的划分方法与实际存在的环境差异较大,导致了该属下物种的精确划分仍然存在较大困难。
DNA条形码技术是一种以DNA为基础的分子标记技术,它在小球藻的分类学上有着得天独厚的优越性。
自2003年第一次被人们引入DNA条形码这一新的概念以来,其发展迅速,已逐渐成为生物学分类学中的一个热门课题。
DNA条形码是一种基于1段标准短序列的生物识别技术,与物种的发育时期无关,具有操作简便、鉴定周期短、可重复性好等特点,可快速、精确地识别单一物种、识别相近物种、识别隐存种等。
在赤潮藻的分子分类学研究中,已经有10多个赤潮藻的基因被认为是赤潮藻的一个重要分支,但至今还没有一个被公认的赤潮藻的条形码标准片段。
COI与ITS因其演化速度快而被广泛应用于近缘组与近缘种的鉴别;Rubisco酶是一类参与植物光合、光呼吸等生理活动的关键酶,其大亚基rbcL是一个高度保守的类群,是目前国际上应用最多的一个类群。
在此基础上,利用COI,ITS,rbcL等三个基因对小球藻进行DNA条形码分析,并对这三个基因进行比较分析,评价其在小球藻分类中的应用价值,从而为进一步开展小球藻的条形码分类和筛选奠定基础。
材料与方法
笔者选择的海带小球藻20个,全部来自中国科学院海带植物种质资源库。以BG-11为基质,25℃、4500lx、12小时的光与暗比例为12:12小时。小球藻的种质资源列于表1中。
采用天根生物技术(北京)股份有限公司提供的生物信息学分析工具,对不同生长阶段的藻细胞进行DNA萃取,并进行PCR扩增与序列测定,获得不同生长阶段的藻细胞DNA。
PCR反应的总容积为25毫升,包含12.5毫升2×TaqPlusPCRMix,1毫升各引物,2毫升DNA模板,8.5毫升超纯水。用PCR方法得到的引物顺序列于表2中。
用1%的琼脂糖对PCR反应的结果进行了分析,并将PCR反应的结果送交上海生工公司进行了序列测定。
采用Sequencher分析程序将两个样本的序列序列进行拼合,并进行手工校正,确认正确后上传到GenBank数据库中。
采用ClustalX2.0软件,对多组数据进行对比和错误检测。应用MEGA7.0对DNA序列进行了序列分析,包括序列长度,GC含量,多态位点,简洁性信息位点等。
利用极大似然分析方法对基因序列的饱和度进行了检测,并利用DAMBE软件绘制了基因的取代饱和度曲线。
采用Kimura-2—parameter方法对不同物种之间之间的遗传距离进行了分析。在此基础上,结合Gen-Bank数据库中已有的资料,利用邻近分析方法,建立具有多个物种间亲缘关系的分子进化树。
以Bootstrap方法对相邻分枝的可靠性进行了测试,并对每个分枝进行了1000次的连续取样,得出了每个分枝的支持程度。通过对三个基因序列在不同物种之间的亲缘关系进行分析。
结果分析
对20个菌种进行了3个基因片段的扩增,结果显示,3个基因片段的扩增结果为76%,83%,70%。每一种可能的DNA条形码都具有其序列特性,在表3中给出。
每个基因的全长均在671-1428bp之间,以ITS为最大值。3个次序的GC浓度也有明显差异,其中ITS最高,COI最低.
利用p-距离及简洁基因座所占比例对3个基因进行了比较,发现ITS具有较高的p-距离及PI%,说明ITS具有较高的遗传多态性。
COI,ITS,rbcL的碱取代饱和度曲线表示在图1中。
由图1可以看出:COI和rbcL的转换值略高于颠换值,而ITS的颠换值高于转换值;
ITS转化过程中出现了一个稳定的过渡阶段,说明ITS转化过程已经趋于饱和;而COI与rbcL的过渡与反转都是直线的,说明这两种基因的替代并没有到达一个完全的饱和状态,更适用于建立一种新的基因进化树。
由于标准DNA条形码所反映的物种之间的遗传差异要比物种内部更大,且具有1个区间,所以物种之间的差异应该在barcodinggap图谱上的低值一边;
而高值一边则是物种之间的高值一边。三个小球藻类DNA条形码的barcodinggap标记在图2中。
从表2中,我们可以看到COI,ITS,rbcL三个基因在物种内和物种之间有一定的交叠。
结果表明:COI值在种内比在种间更大,对该属的分类学研究不利;然而,ITS与rbcL之间虽然有部分交叉,但仍然有间隔区,而且rbcL间隔区较大,对其分类学研究具有重要意义。
已有的3个候选基因的分子进化研究表明,其分枝内部的簇结构混乱,并不符合其形态学特征。
在形态学上,同一种类的小球藻并未完整地归为一个类群,而不同种类的小球藻却未得到有效的区分,这与经典的分类法有很大的不同。
3个候选基因序列中没有一个序列能够对小球藻属中的全部物种进行全面的鉴别,因此推测该基因序列不属于下级分类单元。以COI,ITS,rbcL为基础构建的NJ亲缘关系树见图3。
讨论
理想的DNA条形码序列应具有易于高效扩增、种间差异显著和种内变异较小等特点。
通过对三个候选基因的比较,我们发现3个可能的DNA条形码都不能独立用于种级的区分,但是它们各自具有各自的特征。
笔者对除了刺细胞类以外的其他类的COI基因进行了分析,结果表明COI基因具有长度短、易于扩增、变化速率适中等优点,可用作生物的DNA条形码。
COI是一种被广泛认可的动物DNA条形码,已在贝类、鸟类、鳞翅目等多个物种中被证实。
国内外许多学者和组织对陆地生物进行了不同程度的DNA条形码分析,结果表明COI基因在陆地生物中的演化速度较慢,并且其序列变化较大,不适合用来构建基于COI、ITS和rbcL的NJ谱系树。
在海藻DNA条形码方面,COI已被成功地用于硅藻、甲藻、褐藻和赤藻的DNA条形码分析;但是由于COI的存在,无法对其进行高效的引物筛选,因而不适用于绿藻类的条形码。
我们还发现COI不适用于小球藻,主要是因为缺少资料,在GenBank数据库中没有该物种的COI基因的序列;
在形态学上,常因标本中没有明显的形态学性状,或形态学性状不能满足物种划分的要求而产生偏离。
ITS遗传多样性高,具有很好的鉴别特性,已被广泛用于多种原生生物、真菌、藻类、动植物等的分类学和分子水平的鉴别,但目前以ITS为基础建立的分子进化关系并不能很好地将小球藻属的各类群划分清楚。
Muller等人通过对29种常见小球藻ITS序列的多态分析,指出一些用常规分类学手段鉴别出来的常见小球藻不能归入本类;
笔者根据已有的生物化学及分子生物学数据,将小球藻与一般的小球藻同种异姓,并将两者的ITS序列划分为同一分支。
在本研究实验中,ITS的遗传距离和PI%值均比COI和rbcL高很多,表明其具有较高的变异度;
而碱基替换饱和性分析也证明ITS具有很高的变异度,这可能导致ITS序列不适合单独用于小球藻的系统发育分析。
rbcL是一个具有丰富分子生物学功能的蛋白,在植物光合、光呼吸等过程中起着关键的调控功能。
rbcL由于其在生物学上的局限性,其演化速度相对缓慢,因而更适用于对更高级物种的研究。
在三个条形码序列中,rbcL的遗传距离和PI%都是最小的,说明rbcL的相对于其它三个条形码序列而言,它是一个非常保守的序列。
造成这种状况的主要因素有:试验所采用的藻株存在差异、数据库中的信息错误、样品DNA污染和分类命名错误等,这些因素都会造成分析结果的可信度下降,或者无法找到可以参照的数据。
小球藻是一种重要的经济类群,但由于其种类繁多,其DNA条形码技术尚未完善,至今仍无一种通用的小球藻DNA条形码。
但是,可以借鉴动物和动物的分类学原理,对多个序列进行综合分析,来确定具有不同演化层次的DNA条形码。
由于小球藻DNA序列的多样性和标准化程度的提高,加上DNA条形码技术的不断完善,使得DNA条形码在小球藻的分类学研究中的作用越来越大。
参考文献:
[1]黄燕娟,王小芬,陈向凡《小球藻的营养及药用价值》
[2]孙雪,吴晓微,李兴文,等《小球藻核rDNAITS与叶绿体rbcL基因序列分析及应用》
[3]崔翠菊,张立楠,王娜,等《藻类DNA条形码研究进展》
[4]郭立亮《海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发》
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