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文 | 秋季纪实

编辑 | 秋季纪实

前言

线粒体tRNA作为前体tRNA的长多基因转录本进行转录，经历内切核酸酶加工和甲基化等的后转录修饰，以保证其正确的结构和功能。其中，线粒体tRNA的5'端加工和嘌呤9的N1甲基化是由两个蛋白质复合物催化的，它们具有重叠的亚基组成。

依赖于Mg2+的RNase P复合物用于5'端剪切，包括含有甲基转移酶结构域的蛋白质tRNA甲基转移酶10C、线粒体RNase P亚基（TRMT10C/MRPP1）、短链氧化还原酶羟基类固醇17β脱氢酶10（HSD17B10/MRPP2）和金属核酸酶KIAA0391/MRPP3。

MRPP1-MRPP2亚复合物还催化使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在位置9上形成1-甲基腺苷/1-甲基鸟苷。缺乏结构信息阻碍了对这些复合物如何甲基化和加工线粒体tRNA的理解。

利用X射线晶体学、相互作用和活性分析以及小角度X射线散射（SAXS）相结合的方法，获得了两个tRNA修饰复合物及其组分的结构洞察。

MRPP1的N端参与tRNA结合和单体间自相互作用，C端的SPOUT折叠含有与S-腺苷甲硫氨酸结合和N1甲基化有关的关键残基。整个MRPP1与MRPP2相互作用形成N1甲基化复合物，MRPP1-MRPP2-MRPP3 RNase P复合物只在前体tRNA存在的情况下组装。

MRPP1-MRPP2和MRPP1-MRPP2-MRPP3复合物的低分辨率模型，这些模型揭示了亚基和tRNA底物的整体结构、化学计量比和取向。

MRPP1蛋白质具有一个N端的二聚化结构域

这403个氨基酸（aa）的MRPP1蛋白包括线粒体靶向信号（MTS）、一个富含碱性残基的N域、一个SPOUT折叠甲基转移酶（MT）域，以及C端的约20个aa的延伸。

构建了MRPP1的重组构建体，包括成熟蛋白（MRPP1ΔMTS，aa 40-403）、仅含N域（MRPP1N，aa 40-210）和含有/不含有C延伸的MT域（MRPP1MT+C(Δ194)，aa 195-403；MRPP1MT+C(Δ202)，aa 203-403）。

分子量已知的蛋白质（Mr）使用分子排阻色谱（SEC）研究了纯化蛋白质的寡聚态。MRPP1ΔMTS和MRPP1N的洗脱峰分别在13.75-13.79 ml和15.79-15.82 ml，对应于明显质量分别为87 kDa和34 kDa（MRPP1ΔMTS的计算单体质量为45,374 Da，MRPP1N的计算单体质量为17,825 Da），均为二聚体。

MRPP1MT+C(Δ194)的洗脱体积（Ve）为17.21-17.25 ml，对应于18 kDa的明显质量，与单体一致（MRPP1MT+C(Δ194)的计算单体质量为27,109 Da）。

MRPP1ΔMTS进一步分子量已知的蛋白质（Mr）使用分子排阻色谱耦合多角度光散射（SEC-MALS）进行评估，测定了56 ± 1.12 kDa的明显质量。

这些数据表明，孤立的MRPP1ΔMTS蛋白在溶液中存在单体和二聚体的混合体，二聚化是N端区域介导的。酵母和古菌的Trm10对应物被报告为在溶液中是单体，即使其MTase域存在N端扩展。与其他Trm10蛋白一样，带有C延伸的MRPP1的MTase域在溶液中是单体存在的，N端区域进行二聚化相一致。

MRPP1含有一个SPOUT折叠的甲基转移酶（MTase）结构域，已知能够结合甲基化辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。MRPP1是否结合SAM，采用了差示扫描荧光热稳定性（DSF）来确定蛋白质熔化温度（Tm）在配体诱导下的变化。

MRPP1ΔMTS和MRPP1MT+C(Δ194)在存在SAM的情况下呈剂量依赖性的Tm增加，分别在7.5 mm SAM时达到最大的Tm偏移值分别为6.04 ± 0.09和9.75 ± 0.48 °C。MRPP1N的Tm在存在SAM的情况下未受影响。

MRPP1在预期的SPOUT MTase结构域内结合了SAM，不是N域。MRPP1的MTase结构域还可以结合SAM类似物，例如甲基化产物S-腺苷高半胱氨酸（Tm为5.00 ± 0.18 °C），以及核苷酸，如3'-AMP（Tm为3.65 ± 0.16 °C）。

MRPP1的甲基转移酶结构域采用了单体的SPOUT折叠结构

结构方法对MRPP1进行了表征，以了解其分子特性。由于在纯化过程中易于被蛋白酶水解，尝试结晶MRPP1ΔMTS并不成功。

在存在SAM的情况下结晶了MRPP1MT+C(Δ202)，单同晶反射与异常散射（SIRAS）方法确定了2.49 Å分辨率的含汞衍生结构。

原始数据集分子置换解决了到1.96 Å分辨率，用于后续的模型构建和精化。在最终的模型中，C端延伸（残基380–403）无序在电子密度中不可见。这个结构以后将被称为MRPP1MT。

MRPP1MT显示了经典的SPOUTα/β折叠，由中央的6股β折叠（β1–β6）在两侧被α螺旋（α1–α6）包围而成。SPOUT折叠以C端附近的三叶结为特征，形成一个深槽，容纳了活性位点。

MRPP1的最近结构同源物来自Trm10家族成员，包括TRMT10A（PDB条目4FMW，Z分数26.4，Cα RMSD为1.5 Å，序列同源性26%）、酵母S. pombe的Trm10（4JWF，25.4，1.7 Å，28%）、酿酒酵母S. cerevisiae的Trm10（4JWJ，23.6，1.9 Å，23%）和酸性高温菌S. acidocaldarius的Trm10（5A7T，14.0，2.5 Å，16%）。

MRPP1MT的晶体结构中含有三个分子于不对称单元中（Cα RMSD范围为0.204-0.238 Å），PISA的分子间表面没有揭示导致稳定、与生理相关的寡聚体形成的相互作用。大多数已表征的SPOUT结构域都是二聚体，α螺旋5作为二聚化界面进行介导。

与其他Trm10成员一样，在MRPP1MT结构中，α螺旋5与另一个额外的螺旋（α6）相互堆积，在构建典型的SPOUT二聚体界面方面受到了立体位阻。结构观察与分离的MRPP1MT结构域的分析性SEC一致，已表征的其他Trm10成员蛋白（酵母和古菌的Trm10）一致。

结合SAM的MRPP1结构揭示了活性位点和底物结合表面，每个MRPP1MT亚单位都与一个SAM分子结合。SAM呈L型弯曲构型，位于SPOUT折叠的三叶结区域附近的结合口袋中。

SAM口袋由四个序列高度保守的延伸环围绕，包含了I（aa 288-294）、II（aa 307-323）、III（aa 335-338）和IV（aa 350-360）的基序。SAM腺嘌呤部分（N1、N7和外环N6原子）与Leu-336、Lys-349和Leu-351的主链原子形成主链氢键。

蛋氨酸部分的羧基与Asp-314和Ser-322的侧链形成侧链氢键，与Ser-322、Thr-321和Gln-318的主链原子形成主链氢键。

核糖2'-3'-OH部分与Gly-310主链酰胺形成氢键。SAM的甲基Cϵ原子一个通向广泛的正电荷表面的轴可访问（Lys-216、Arg-217、Lys-218、Arg-235、Arg-236、Arg-256、Lys-260、Arg-261、Lys-265、Lys-268、Lys-315、Arg-358、Lys-378和Arg-379），这可能有助于底物tRNA的结合。

m1R MTases的晶体结构，包括Trm10（m1G9）和TrmD（m1G37），都有一个保守的天冬酰氨酸残基，被认为起到从鸟嘌呤的N1原子中提取质子、促进甲基化的作用。对于酿酒酵母，相应的天冬酰氨酸残基被认为与其他含有羧基的残基一起作用，促进所需的催化离子化。

对于腺苷而言，已有研究表明这个残基可能从外环的N6原子中提取质子，形成亚胺酮异构体。在MRPP1中，残基Asp-314在150个同源体中严格不变，与Ser-316、Met-317的主链酰胺以及SAM蛋氨酸基团的NH3+团氢键相互作用。

Asp-314与SAM转移的甲基碳（Cϵ）原子之间的距离为4 Å，这使其可能在质子提取中发挥作用。MRPP1的另一个活性位点残基在同源蛋白中严格不变，位于α螺旋1中，其侧链指向活性位点。

MRPP1利用多个区域与MRPP2相互作用

MRPP1在体内的表达和稳定性取决于MRPP2，这暗示了MRPP1和MRPP2之间存在一个物理复合物，这在之前已经得到了证明。

当应用含有过量MRPP2的重组MRPP1ΔMTS进行分析性分子排阻色谱（SEC）时，这会产生一个复合物的峰值（Ve = 11.72 ml），以及两个后续的峰值，对应于未复合的单个组分（MRPP1ΔMTS的Ve = 13.48 ml，MRPP2的Ve = 13.79 ml）。

复合蛋白保留了与辅因子（NADH）和甲基供体（SAM）结合的能力，如差示扫描荧光热稳定性（DSF）实验所示。当MRPP2与MRPP1N或MRPP1MT(Δ194)混合时，未观察到复合物峰值。这表明MRPP1的N和MT域均需要与MRPP2相互作用。

大肠杆菌双开放阅读框系统共同表达，确定了MRPP1ΔMTS-MRPP2复合物的生物物理学特性和酶活性，其中MRPP1ΔMTS在N端带有His标签，MRPP2不带标签。

MRPP2仅与His-MRPP1ΔMTS一起在亲和色谱树脂上共同纯化，与His-MRPP1N或His-MRPP1MT(Δ194)没有一同纯化。这与分析性SEC的发现相一致，即MRPP1的N和MT域均需要与MRPP2相互作用。

MRPP1和MRPP2的共表达还消除了在单独表达MRPP1ΔMTS时观察到的降解现象。MRPP1ΔMTS-MRPP2复合物的SEC-MALS显示质量为194 ± 1.16 kDa，表明在复合物中有2个MRPP1ΔMTS单体和4个MRPP2单体的化学计量比，预期质量为208 kDa。

为了确定MRPP1与MRPP2相互作用的序列区域，使用SPOT技术生成了整个MRPP1序列的一系列重叠的15个氨基酸片段，用带有His标签的MRPP2进行检测，进行免疫印迹分析。

在MRPP1的两个域中都找到了七个可能的结合区域的足迹，其中最强的结合肽段位于N域的aa 100-105范围内。在N域结束和MT域开始之间找到了额外的结合肽段（以下称为连接区），在MT域内以及C延伸内也找到了其他结合肽段。

当映射到MRPP1203-380结构上时，区域3、4和6都是表面暴露的。区域3和4距离结构的起点较近，并与连接区域2（相隔七个残基）聚集在一起。

区域6位于结构末端附近的一个可移动环中，酵母Trm10中的等效区域已被证明在活性中发挥作用。MRPP1的N域、MT域和C延伸区域都参与了与MRPP2的相互作用，这与SEC和共表达数据一致。

MRPP1的N域参与了tRNA的结合，与来自较低真核生物的Trm10不同，MRPP1的m1R9 MTase活性需要在二聚复合物中存在MRPP2。首先分子排阻高效液相色谱（HPLC）确认了tRNA与MRPP1ΔMTS-MRPP2复合物的结合，导致了一个蛋白质-tRNA复合物的分离峰。

电泳迁移位移实验（EMSA），还确认了tRNA与MRPP1-MRPP2的结合，当与MRPP1ΔMTS-MRPP2结合时，RNA染色的带子发生了迁移。先前的EMSA研究已经显示MRPP1可以结合tRNA底物。EMSA结果还显示，当仅存在MRPP1N时，RNA染色的带子也发生了迁移，这表明该结构域参与了tRNA的结合。

MRPP2对MRPP1的甲基转移酶功能是必需的

使用[甲基-3H]SAM和纯化的tRNA（用于m1G9甲基转移酶活性的pre-(mt)tRNAIle和用于m1A9甲基转移酶活性的pre-(mt)tRNAVal）作为底物，测量了体外tRNA甲基转移酶活性。

共表达的MRPP1ΔMTS-MRPP2复合物，不是单独的MRPP1ΔMTS或MRPP1MT(Δ202)，能够甲基化pre-(mt)tRNAIle和pre-(mt)tRNAVal。

该复合物的m1G9和m1A9甲基转移酶活性在MRPP1中D314N或Q226A取代时均被废除，确认了严格不变的Asp-314和Gln-226残基的必要催化作用。在SEC中没有形成复合物的MRPP1MT + MRPP2和MRPP1N + MRPP2蛋白混合物也没有表现出tRNA甲基转移酶活性。

MRPP1的存在是否会影响MRPP2在MRPP1ΔMTS-MRPP2复合物中的SDR功能。在使用神经甾体醇醇孕酮作为MRPP2底物测量的3α-HSD活性显示出与仅MRPP2蛋白相似的Vmax。

进一步的研究将确定与MRPP2单独相比，复合物的Km（醇孕酮）降低了2倍是否表明了MRPP1增强了MRPP2的活性。MRPP2对于MRPP1的甲基转移酶活性是必需的，在MRPP1-MRPP2复合物内的MRPP2作为SDR完全具备功能。

在tRNA的存在下，MRPP1-MRPP2复合物与Mg2+-依赖的内切核糖核酸酶MRPP3相互作用，形成三元RNase P复合物，负责5'-端的pre-(mt)tRNA处理。

成熟的MRPP3蛋白（MRPP3ΔMTS）包含一个N端延伸（aa 51-206）、五肽重复（PPR）结构域（aa 207-328）、核心域的前半部分（aa 329-360）、催化NYN结构域（aa 360-541）和核心域的后半部分（aa 342-583）。

结论

不清楚MRPP3如何与MRPP1-MRPP2二元复合物或pre-(mt)tRNA底物相互作用，MRPP3预计是这个RNase P复合物的催化亚基。

混合分别表达或共表达的MRPP1和MRPP2与MRPP3来重构了三元复合物。MRPP1ΔMTS、MRPP2和MRPP3ΔMTS的预混合混合物被应用于SEC柱，主要以对应MRPP1-MRPP2复合物和单个蛋白的峰值洗脱，不是三元复合物。

将三种蛋白与过量的pre-(mt)tRNA一起孵育的混合物产生了比二元复合物更早的洗脱峰，表明出现了更大的分子量物种。 SDS-PAGE分析确认了这个峰中所有三种蛋白的存在。

MRPP3ΔMTS与其两个伴侣蛋白MRPP1ΔMTS和MRPP2之间的相互作用是其pre-tRNA底物的存在来促成的。MRPP3的C端区域（aa 274-583），包含RNase P活性的内切酶结构域，对于与MRPP1、MRPP2和pre-(mt)tRNAIle的复合物形成是不足够的。

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