膀胱癌 (BC) 一直是美国治疗和监测费用最高的十大癌症之一，估计每年累计费用为 40 亿美元，占所有癌症相关治疗费用的 3.2% [ 1 ]。膀胱镜检查是检测和监测 BC 疾病的金标准方法。然而，它是一种侵入性检查，费用相对较高，会给患者带来焦虑、不适和疼痛。膀胱镜检查还存在感染、血尿、尿道出血、下尿路症状、性功能下降和生活质量下降的风险 [ 2 , 3该技术本身并不完善：它依赖于操作者，无法检测到尿道内的小乳头状病变和高达 30% 的扁平恶性病变（与使用传统白光膀胱镜检查相比）[ 4]。出于这些原因，泌尿科医生在诊断和监测决策中，50 多年来一直依赖排尿细胞学检查作为辅助和非侵入性检查来补充膀胱镜检查。细胞学对高级别肿瘤确实具有高敏感性和特异性，但它存在高假阳性率的问题，这取决于解释者的经验，尤其是在之前接受过膀胱内治疗、放疗、炎症或神经源性膀胱的情况下。细胞学在检测低级别病变方面的表现会大大下降，当脱落的尿路上皮细胞被解释为非典型时，它会增加严重的诊断难题膀胱镜检查和细胞学检查相对于其在膀胱癌检测中的局限性而言成本较高，这促使研究人员利用快速发展的基于分子的精准医学领域来发现在不同临床情况下具有高灵敏度、高特异性和高成本效益的尿液生物标志物。

目前市场上有多种尿液生物标志物可用于检测和监测膀胱癌，其中一些已获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 的批准（表10.1和10.2）。这些生物标志物采用不同的检测方法来检测膀胱癌中的核酸、蛋白质抗原和染色体畸变。尽管如此，国家和国际指南对 FDA 批准的生物标志物的采用仍然有限，因为这些检测虽然比细胞学检查灵敏度更高，但无法取代膀胱镜检查 [ 5、6、7 ]。细胞学检查相对于这些生物标志物的特异性更高，这也阻碍了它们在学术研究环境之外的广泛应用。

尖端的新一代测序和强大的生物信息学平台不断增加我们对导致乳腺癌发生、疾病进展和治疗反应调节的分子途径的了解。与此同时，许多新型尿液生物标记物正在被识别和开发，这些标记物可以捕捉乳腺癌的分子异质性，从而提高检测率。较新的检测方法将 DNA 突变、DNA 甲基化状态、调节性 RNA 分子、蛋白质组学和代谢组学添加到测试面板中的乳腺癌目标池中，这在提高尿液测试的诊断质量方面显示出巨大的潜力。本章总结了目前市场上可用于膀胱癌诊断和监测的生物标志物，并强调了涵盖蛋白质、基因组、表观遗传、转录组、炎症、代谢组和组合生物学靶点的新兴尿液生物标志物的科学原理（图）。10.1）。

图 10.1

用于检测、监测和对 BCG 反应的尿液生物标志物摘要。包括每类生物标志物（例如基于细胞的与蛋白质的）的选定示例（颜色编码）。星号表示 FDA 批准的标志物。FISH 荧光原位杂交、NMP22 核基质蛋白、TERT 端粒酶逆转录酶、FGFR3 成纤维细胞生长因子受体 3、S100A4 S100 钙结合蛋白 A4、IGF2 胰岛素样生长因子 2、CAIX 碳酸酐酶 IX、AURKA 极光 A 激酶、BCG 卡介苗、IL 白细胞介素

定义理想的膀胱癌诊断和监测测试

一般而言，生物标志物是指生物过程的标志物，可以提供有关疾病状态或未来疾病风险的信息 [ 8 ]。考虑到膀胱镜检查在膀胱癌检测和监测中的副作用和成本，人们对开发尿液生物标志物非常感兴趣，这种标志物可以胜过排尿细胞学检查，可以增强膀胱镜检查或安全地替代它。根据 2015 年世界卫生组织/国际泌尿系统疾病咨询会关于膀胱癌检测和监测生物标志物的共识声明，理想的生物标志物必须更简单、更好、更快、更便宜才能将其完全纳入标准临床实践 [ 9 ]。更简单、更优质与样本采集和处理的简易性、不同临床环境下（即学术中心与社区中心）的分析要求和测试可重复性有关。更快速、更便宜与生物标志物的成本效益有关，不仅要考虑提供者和患者的时间和便利性（例如，在办公室或家中进行即时检测），还要考虑假阳性结果对经济和生活质量的影响 [ 10 ]。

生物标志物的性能通常通过其敏感性、特异性、阳性预测值 (PPV) 和阴性预测值 (NPV) 来判断。判定测试为阳性或阴性的检测阈值将影响标志物的敏感性或特异性。换句话说，设定的阈值决定了检测真阳性与假阳性以及真阴性与假阴性测试结果的可能性。因此，高阈值将提高特异性而降低敏感性（假阳性更少，假阴性更多）。相应地，低阈值将提高敏感性而降低特异性（假阴性更少，假阳性更多）[ 9 ]。

在临床环境中，医护人员和患者往往认为预测值比敏感性或特异性更有意义且更容易解释。PPV 定义了检测结果为阳性的患者患病的概率。它表示检测结果为阳性的患者中患病患者的比例。NPV 定义了检测结果为阴性的患者未患病的概率。它是检测结果为阴性的健康患者占检测结果为阴性的患者的比例。与敏感性和特异性不同，预测值受疾病流行率的影响。这一概念在生物标志物的开发和验证中具有重要意义。例如，为膀胱癌的初步诊断而开发的大多数生物标志物研究都使用了病例对照队列，这些队列的疾病患病率很高，不能反映现实世界的实际模式。这导致对生物标志物性能的评估过高，特别是其 PPV，这无法在后续的验证研究中重现。由于该人群中膀胱肿瘤的患病率较高，这个问题也蔓延到了监测环境中。PPV 将超过尿液细胞学的 PPV，在某些情况下，在膀胱镜检查发现复发性肿瘤之前，测试就会呈阳性。这造成了诊断困境，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法将假阳性测试与真阳性测试区分开来[此类人群的发病率很高，无法反映现实世界的实际模式。这会导致对生物标志物性能的评估过高，特别是其 PPV，而这在后续的验证研究中无法重现。由于此类人群中膀胱肿瘤的发病率较高，这一问题也蔓延到了监测环境中。PPV 将超过尿液细胞学检查的 PPV，在某些情况下，在膀胱镜检查发现复发性肿瘤之前，检测结果就会呈阳性。这造成了诊断困境，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法可以将假阳性检测与真阳性检测区分开来 [此类人群的发病率很高，无法反映现实世界的实际模式。这会导致对生物标志物性能的评估过高，特别是其 PPV，而这在后续的验证研究中无法重现。由于此类人群中膀胱肿瘤的发病率较高，这一问题也蔓延到了监测环境中。PPV 将超过尿液细胞学检查的 PPV，在某些情况下，在膀胱镜检查发现复发性肿瘤之前，检测结果就会呈阳性。这造成了诊断困境，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法可以将假阳性检测与真阳性检测区分开来 [在后续验证研究中无法重现。由于该人群中膀胱肿瘤的患病率较高，这一问题也蔓延到监测环境中。PPV 将超过尿液细胞学，在某些情况下，在膀胱镜检查发现复发性肿瘤之前，检测结果会呈阳性。这造成了诊断困境，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法可以将假阳性检测与真阳性检测区分开来[在后续验证研究中无法重现。由于该人群中膀胱肿瘤的患病率较高，这一问题也蔓延到监测环境中。PPV 将超过尿液细胞学，在某些情况下，在膀胱镜检查发现复发性肿瘤之前，检测结果会呈阳性。这造成了诊断困境，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法可以将假阳性检测与真阳性检测区分开来[这造成了诊断难题，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法来区分假阳性检测和真阳性检测。这造成了诊断难题，因为在没有可见肿瘤的情况下，没有简单的方法来区分假阳性检测和真阳性检测。9 ]。最终，生物标志物的有效使用取决于医疗服务提供者自己，他们需要根据最能满足其特定临床需求的性能特征来选择生物标志物（例如，高灵敏度以检测持续性或复发性高级别肿瘤），同时也要考虑到患者的观点[ 11 ]。

目前市场上可用的膀胱癌诊断检测尿路感染

这是一项基于细胞的检测（美国伊利诺伊州雅培公园的雅培实验室），利用荧光原位杂交 (FISH) 检测尿液中脱落尿路上皮细胞中 3、7 和 17 号染色体数量增加以及 9p21（p16 肿瘤抑制基因的位点）缺失。该检测于 2000 年开发，并于 2001 年获得 FDA 批准，用于监测有尿路上皮癌病史的患者的肿瘤复发情况。该标签后来于 2005 年扩展，作为对疑似患有 BC 的血尿患者的初步诊断的辅助手段 [ 12]。该检测不受血尿、炎症和其他可能导致其他标志物出现假阳性结果的因素的影响，是现有生物标志物中特异性最高的检测之一。累积数据表明，与尿液细胞学相比，UroVysion 对所有等级和阶段的灵敏度更高 [ 13 , 14 ]。最近的荟萃分析显示，总体灵敏度为 63% (50–75%)，特异性为 87% (79–93%) [ 15 ]。总体而言，特异性低于癌症检测的细胞学。

使用该检测法检测膀胱癌的两个主要缺点是缺乏在仪器环境下定义细胞为“异常”的具体标准，以及假阳性率，即使在对细胞学异常的患者进行长期随访后，假阳性率仍然很高 [ 16 ]。此外，与其他标记物一样，UroVysion 可以根据患者特征（例如年龄和吸烟状况）和检测指征（即存在症状还是癌症监测）而发挥不同的作用 [ 17]]。也有可能并非所有膀胱肿瘤都具有当前 FISH 检测中检测到的突变。在最近一项前瞻性、病理学证实的膀胱冲洗尿液样本分析中，UroVysion 在敏感性（67% vs. 69%）或特异性（72% vs. 76%）方面均未显著优于尿液细胞学，这与汇总研究相矛盾。此外，31% 的肿瘤没有 3、7、17 或 9p21 染色体的非整倍性 [ 18 ]。目前，UroVysion 不是初始膀胱癌检测国家指南的一部分 [ 5 ]。

膀胱肿瘤抗原 (BTA)

该检测使用单克隆抗体（Polymedco，Cortlandt Manor，纽约，美国）检测补体因子 H 相关蛋白和补体因子 H，它们存在于膀胱癌细胞系中，可抑制补体级联以防止细胞裂解。定量 BTA（BTA Trak R）检测在专门的实验室中进行（使用比色免疫测定法或 ELISA），而定性 BTA（BTA Stat R）是一种可立即获得结果的即时检测（试纸免疫测定法）。BTA Stat R的汇总灵敏度和特异性分别为 64%（58-69%）和 77%（73-81%）[ 15 ]。BTA Trak R的汇总灵敏度和特异性分别为 65% (54–75%) 和 74% (64–82%)。这两项检测均已获 FDA 批准用于检测 BC，其灵敏度高于细胞学检测，但当良性病变（包括血尿、肾结石、炎症、近期仪器操作和 BCG 治疗）中存在补体因子 H 相关蛋白时，特异性会显著降低 [ 19 ]。

Cx 膀胱

该检测是一种基于信使 RNA (mRNA) 的测试（Pacific Edge Diagnostics，新西兰达尼丁），可检测五种基因的转录本：IGFBP5、HOXA13、MDK、CDK1 和 CXCR2。该检测被开发为三种不同的测试，包括 Triage™、Detect™ 和 Monitor™，适用于不同的临床情况。分诊结合患者风险概况（年龄、性别、吸烟暴露、血尿史）来生成基因组表型评分，可帮助选择患者避免不必要的血尿检查。在 587 名肉眼血尿患者中，该测试的灵敏度为 95.1%，阴性预测值为 98.5%。40% 的患者被准确“分诊”，癌症概率较低 [ 20]。Detect™ 检测仅包括定量聚合酶链反应 (PCR) 面板，但用于肉眼血尿的高危患者。在 485 名患者中，该检测的总体敏感性为 82% (70–90%)，优于细胞学或 NMP22 检测，特异性为 85% (81–88%)。有肾结石病史的患者特异性降低 (68%) [ 21 ]。高级别肿瘤的敏感性为 97%，表明在现实环境中有助于确定膀胱镜检查的优先次序。医疗保险目前涵盖 Detect™ 和 Monitor™。截至 2021 年初，所有 Cx 膀胱测试尚未获得 FDA 批准。

NMP22 膀胱检查

核基质蛋白 22 (NMP22) 参与有丝分裂期间染色质的分布，与正常尿路上皮相比，它在恶性尿路上皮细胞中升高 [ 22 ]。它会从凋亡细胞中释放到尿液中，该检测使用两种针对基质蛋白的抗体。NMP22 BladderChek 是一种定性即时诊断检测（目前以 Alere NMP22 BladderChek 的名称销售，Alere，美国密苏里州圣路易斯），已获得 FDA 批准，可用于有症状患者的诊断和随访。该检测设置简单，30 分钟即可完成。根据 22 项研究，BladderChek 的汇总灵敏度和特异性分别为 64%（58–69%）和 77%（73–81%）[ 15: 与其他商用检测一样，该检测的灵敏度高于细胞学检测，但由于良性病变和某些药物（如降血压药），其假阳性率很高[ 23 ]。该检测在筛查有症状且癌症风险较高的患者（吸烟或接触其他化学物质）方面已显示出一定效用。一项研究在 224 名 NMP22 浓度升高的高危患者中，正确预测了 6 例膀胱癌，灵敏度为 97%，特异性为 29%，NPV 为 99% [ 24 ]。但是，支持将其用作初始筛查测试的数据仍然有限。

专家检测

该检测是基于 mRNA 的检测（Cepheid，美国加利福尼亚州桑尼维尔），可量化五种基因（UPK1B、IGF2、CRH、ANXA10 和 ABL1）的转录本。一项多机构研究最近在 828 名接受膀胱镜检查以诊断镜下或肉眼血尿的患者中验证了该检测。Xpert 的总体敏感性为 78%（66-87%），对高级别肿瘤的敏感性为 90%（76-96%）。总体阴性预测值为 98%（97-99%）[ 25 ]。与细胞学检查相结合并未提高检出率。该检测尚未获得 FDA 批准，但考虑到其敏感性高于其他检测、易于使用（不需要 PCR 实验室）和结果快速（90 分钟），它很有前景。它也不受操作员限制，似乎不受良性血尿的影响。

尿路感染

该检测使用新一代测序技术检测 TERT 启动子突变（这种突变在高达 80% 的膀胱癌中发生）以及另外 10 种基因突变：FGFR3、PIK3CA、HRAS、KRAS、TP53、CDKN2A、ERBB2、MLL、MET 和 VHL [ 26 ]。在初始检测队列中，83% 的膀胱癌患者使用 UroSEEK 检测呈阳性。结合细胞学检查，灵敏度和特异性分别为 95% 和 93%。所调查的绝大多数肿瘤在检测组中至少出现一种突变。UroSEEK 还可有效检测细胞学异常的病例，预测 95% 的细胞学异常的癌症患者会进展 [ 27]。对细胞学异常且之前未诊断出癌症的患者进行的一项随访研究显示，敏感性、特异性和 NPV 分别为 96%、88% 和 99%。尽管这些结果很有希望，但这种检测方法仍处于研究阶段，尚未广泛传播。

确保MDx

这是一项基于 DNA 的检测方法（MDx Health，美国加利福尼亚州欧文市），可检测 FGFR3、TERT 和 HRAS 突变以及 OTX1、ONECUT2 和 TWIST1 甲基化。这些结果与患者年龄相结合，可得出 BC 的风险概况，并可能有助于避免出现血尿的患者进行膀胱镜检查。该检测方法仍被视为研究性方法，截至 2021 年初尚未获得 FDA 批准。迄今为止，两项研究的汇总敏感性和特异性分别为 95%（87-98%）和 85%（79-89%）[ 28 ]。这些研究调整了膀胱癌 5-10% 的患病率，显示阴性预测值为 99.6%，这将减少 77% 的膀胱镜检查[ 29,30 ]]。该检测可能对筛查有症状性血尿的低风险患者有用，有待美国正在进行的临床试验（NCT03122964）进一步的前瞻性验证。

目前用于膀胱癌监测的商业检测尿路感染

事实证明，UroVysion 有助于确定具有非典型或阴性细胞学检查的复发风险较高的患者。“预期阳性”读数被认为反映了癌症表型表达发展之前的染色体变化，因此不被视为假阳性。几份报告显示，很大一部分患者的读数为阳性，但膀胱镜检查阴性的患者最终会在 2 年内出现临床可检测到的肿瘤 [ 31、32、33 ] 。此外，FISH阴性的患者不太可能在不到 1 年的时间内出现复发[ 32 ]]。总体研究表明，当该检测用于高级别膀胱癌监测（尤其是原位癌）时，特异性更高 [ 14、34、35 ] 。也有数据支持 Urovysion 在预测对 BCG 的反应方面发挥作用。BCG 后检测呈阳性的患者肿瘤复发风险比检测呈阴性的患者高出三到五倍 [ 36、37、38、39 ]。还有数据表明，Urovysion 阳性可能预示着在 BCG 治疗期间出现更高进展的可能性[ 40、41 ]]。基于此，最近有人提议用该检测来检测膀胱镜检查阴性但 BCG 诱导后不久 FISH 呈阳性的患者中的“分子 BCG 失败”[ 42 ]。然而，目前的国家指南除了帮助解释不确定的细胞学结果外，并没有强烈建议在癌症监测中常规使用 UroVysion [ 6,5 ]。该检测仍然仅限于协助泌尿科医生进行患者咨询和招募，以比较 BCG 与新型膀胱内和全身药物的临床试验[ 43 ]。

免疫细胞/uCyt+

这是一项基于细胞的检测（Scimedx，美国新泽西州丹维尔），结合了细胞学和免疫荧光测定。它使用荧光标记的单克隆抗体来对抗糖基化癌胚抗原和两种膀胱粘蛋白。脱落尿路上皮细胞上的这些抗原对膀胱癌具有特异性。该检测不受良性病症的影响，但需要训练有素的细胞病理学家和至少 500 个细胞的样本才能有效。它于 1997 年首次推出，仅经 FDA 批准用于监测。在检测低度肿瘤方面，该检测比其他 FDA 批准的生物标志物表现更好[ 44 ]。在最近结合八项研究的荟萃分析中，灵敏度和特异性分别为 75%（64-83%）和 76%（70-81%）[ 15]。一项针对 91 名患者的前瞻性研究表明，该标志物与无复发生存期或无进展生存期无关 [ 45 ]。对于细胞学检查阴性但检测结果阳性的患者，uCyt+ 不能预测复发 [ 46 ]。由于解释复杂且高度依赖于操作员，该检测的传播仍然有限。AUA 对细胞学检查异常的患者使用 uCyt+ 的推荐程度较弱。

BTA 统计/BTA 轨迹

BTA stat 的敏感性、特异性和阴性预测值分别为 40% 至 72%、29% 至 86% 和 38% 至 77% [ 22 ]。最近的一项前瞻性研究将这种标记物与其他市售标记物进行了比较，结果表明 BTA stat 不能预测复发或进展 [ 45 ]。在 368 名膀胱镜检查结果呈阳性但初始膀胱镜检查结果为阴性的患者中，在进行影像学和随机活检后，未发现复发的风险约为 16% [ 47 ]。对 BTA trak 的研究更为有限。总体而言，敏感性和特异性分别为 54% 至 62% 和 68% 至 87% [ 22 ]。一项研究报告了 88.4% 的阴性预测值 [ 48]。一些研究确实对BTA trak和BTA stat进行了比较，发现两种检测方法的性能相似，尽管BTA trak在检测复发性肿瘤方面具有更高的灵敏度[ 49 ]。这些检测方法获得了FDA批准，作为膀胱镜检查的辅助手段用于监测目的（而非检测），但由于血尿和/或良性疾病患者的假阳性率高（高达80%），其临床应用仍然有限[ 50,51 ]。

NMP22 膀胱检查/NMP22-BC

BladderCheck 也已获得 FDA 批准用于监测。汇总敏感性和特异性分别为 70% (40–89%) 和 83% (75–89%) [ 5 ]。一项针对 668 名接受监测患者的多中心研究表明，膀胱镜检查与 BladderChek 相结合可将诊断准确率提高到 99% (94–100%)，优于单独进行膀胱镜检查 [ 52 ]。一项将 BladderChek 与 BTA Stat 和 Immunocyt/uCyt 进行比较的研究表明，BladderChek 是唯一可预测复发和进展的标志物 [ 46]。NMP22-BC 是 BladderChek 的定量对应物。该检测是一种利用两种单克隆抗体的 ELISA 检测。目前，该检测仅经 FDA 批准用于监测。与 BladderChek 一样，NMP22-BC 检测的灵敏度高于细胞学检测，但特异性较低。与 BladderChek 相比，该检测的灵敏度和特异性较低，分别为 61% (49–71%) 和 71% (60–81%) [ 5 ]。一项研究使用制造商的 10 单位/毫升截止点生成了包括年龄、性别和细胞学以及 NMP22 的列线图 [ 53] 的复发预测准确率为 84.2%。总体而言，NMP22 检测可作为检测膀胱癌的辅助工具，但单独使用或与细胞学检查结合使用时，其监测诊断性能有限 [ 54 ]。

Cx 膀胱监测仪

这项前瞻性研究分析了该检测方法，研究对象为 763 名既往患有非肌层浸润性疾病的病人，并将既往肿瘤发生信息（原发性肿瘤与复发性肿瘤、距既往肿瘤发生时间，以年为单位）添加到 Cx bladder triage™ 和 detect™ 中测量的五个基因表达谱中。灵敏度和阴性预测值分别为 92% 和 96%。无论自治疗完成以来的间隔时间如何，其性能与分期、分级和 BCG 治疗无关 [ 55 ]。一项后续研究在 803 名病人中将该检测方法与 FDA 批准的检测方法（包括 NMP22 ELISA、NMP22 BladderChek 和细胞学检查）进行了比较。Cx bladder 的灵敏度和 NPV 优于包括细胞学检查在内的所有检测，分别为 91% 和 96% [ 56]在一项对 852 例细胞学检查异常（无论是否进行过可疑膀胱镜检查）患者的汇总回顾性分析中，该检测的 NPV 值为 97%（94-98%），可使 35% 的患者避免不必要的膀胱镜检查[ 57]。在将 Cx bladder monitor™ 纳入现实世界监测队列后，对新西兰膀胱镜检查模式进行了回顾性审计，结果显示该测试有助于识别复发风险较低的患者；阴性测试结果患者的复发风险比阳性测试结果患者的复发风险低 16.2 倍。约 77.8% 的患者每年进行一次膀胱镜检查即可安全管理，且检测率不受影响，从而减轻了膀胱镜检查的总体负担。目前的结果非常令人鼓舞，尽管所有三种 Cx 膀胱测试目前尚未获得 FDA 批准，因为需要进行更多的前瞻性验证。

尿路监测

该检测是一种 RT PCR 检测（U-Monitor，波尔图，葡萄牙），针对脱落尿路上皮细胞 DNA 中 TERT 启动子（端粒酶逆转录酶）和 FGFR3（成纤维细胞生长因子受体 3）基因热点突变的检测进行了优化。该检测由中央实验室处理，周转时间为 3-5 天。它首先在 331 个尿液样本中进行了验证，在检测复发方面显示出 74% 的敏感性和 93% 的特异性，与单独的膀胱镜检查相当。当与膀胱镜检查相结合时，该测试实现了 100% 的敏感性和 89% 的特异性，高于膀胱镜检查结合细胞学检查的敏感性和特异性（敏感性为 87% 和特异性为 88%）[ 58]。最近，致癌基因 KRAS 的突变被添加到该检测组 (Uromonitor-V2) 中，并在 97 名接受非肌层浸润性疾病监测的患者中进行了检测。灵敏度提高到 93.1%，NPV 为 95%，高于细胞学检查，使其成为细胞学/膀胱镜检查的有前途的替代方案 。此外，炎症或其他良性病变的存在似乎不会影响该检测的性能 ]。

Epicheck

该检测包括 15 种专有 DNA 甲基化标记（Nucleix，美国加利福尼亚州圣地亚哥），这些标记在膀胱癌中经常发生改变。从离心尿液的细胞沉淀中提取 DNA，并用甲基化敏感的限制酶消化。然后，该检测使用具有位点特异性引物的逆转录 (RT) PCR。每位患者的报告包含定量评分 (EpiScore) 和阳性/阴性解释。EpiScore 是一个介于 0 到 100 之间的数字，分数越高表示甲基化程度越高；EpiScore ≥60 被视为阳性结果 [ 61353 中的原始报告显示，总体敏感性和特异性分别为 68.2% 和 88%。排除低级别疾病后，敏感性和 NPV 分别提高到 92% 和 99%。年龄、性别、近期复发治疗、吸烟史和职业暴露对检测性能没有影响 [ 61 ]。一项后续研究测试了该检测与细胞学检测，结果显示敏感性更高（62% vs. 33%），尤其是对于高级别肿瘤（83% vs. 46%）。然而，细胞学检测的特异性更高，为 98.6%，而 EpiCheck 为 86.3% [ 62]。目前，仅凭这些数据，该检测还不能取代膀胱镜检查或细胞学检查。尽管如此，Epicheck 可能有助于减少对细胞学解释不典型或可疑高级别癌患者的膀胱镜监测 [ 63 ]。鉴于其与其他商业检测相比的成本和技术挑战，Epicheck 在监测实践中的应用仍然有限。

潜在的尿液生物标志物蛋白质生物标志物

蛋白质生物标志物在膀胱癌检测中得到了广泛研究，可通过免疫测定或光谱法进行量化。检测尿液蛋白质生物标志物非常方便，因为它们有助于创建高效的即时检测，可快速获得结果，而更复杂的分子技术则需要最佳的样本采集，并且只能由专门的实验室进行。研究最广泛的蛋白质之一是 survivin，它已被证明可促进细胞增殖并增强多种肿瘤的血管生成 [ 22 ]。使用 ELISA 定量 survivin 报告称，检测 BC 的灵敏度为 71-85%，特异性为 81-95% [ 64]。Survivin 已被证明与疾病复发和疾病特异性死亡率相关 [ 65 ]。Orosomucoid 1 (ORM1) 调节急性期反应期间免疫系统的活性。与对照组或良性病变患者相比，膀胱癌患者的 ORM1 显著升高，敏感性、特异性和 AUC 分别为 92%、94% 和 0.965 [ 66]。丝氨酸蛋白酶HtrA1与多种癌症有关，其敏感性为93%，特异性为96%，AUC为0.98。在尿液中可检测到这种蛋白质的两种亚型，与健康和膀胱炎患者相比，癌症患者的尿液中这种蛋白质的表达显著下调。角蛋白17 (K17)是细胞角蛋白家族的成员，已被证明能促进细胞逃脱G1-S期细胞周期控制，从而导致癌症细胞增殖，在检测BC时显示出100%的敏感性和96%的特异性。有趣的是，活检和细胞学样本的免疫组织化学在低级别和高级别病变中检测到K17，但在正常尿路上皮中未检测到，表明这种生物标志物可作为膀胱镜检查和细胞学检查的辅助手段在监测疾病复发中发挥作用[ 67]。

其他单个蛋白质标志物包括 APO-A1（载脂蛋白 A1）、BLCA-4 和透明质酸酶，这些标志物已在检测环境中通过两项或多项研究独立验证，总体上超过了 FDA 批准的基于 NMP22 和 BTA 蛋白质的检测方法的灵敏度（89-95%、93%、89-100%）和特异性（85-92%、97%、89-91%）[ 68 ]。测量多种蛋白质的检测组合提高了检测特异性。例如，使用 γ-突触核蛋白与 Coronin-1A、APO-A4、Semenogelin-2 和 DJ-1/PARK7 的五种生物标志物分别实现了 79%、100% 和 0.92 的灵敏度、特异性和 AUC。血尿或脓尿不影响检测性能 [ 69]。分析特定于监测或治疗反应的蛋白质生物标志物性能的研究较少，但组合组的数据非常有希望。例如，包括六种生物标志物（钙粘蛋白-1、IL-8、ErbB2、IL-6、EN2 和 VEGF-A）和三种临床参数（既往复发次数、BCG 治疗次数和诊断时的分期）的多参数检测，在检测复发方面产生的 AUC 为 0.92，优于单个生物标志物 [ 70 ]。大多数组合组需要更大规模的独立验证。

基因组生物标志物端粒酶

端粒酶逆转录酶启动子 (TERTp) 的热点突变存在于 70% 以上的膀胱癌中，使其成为最常见的基因组畸变，与分期或分级无关 [ 58 ] 。对于初步诊断，基于 PCR 的检测的敏感性和特异性分别为 62-87% 和 84-100% [ 71、72、73、74、75 ] 。最近的一项嵌套病例对照研究表明， TERTp突变在诊断前 10 年内即可在尿液中检测到，敏感性为 47%，估计 NPV 为 99.95% [ 76 ] 。TERTp突变还与复发的相对风险增加 5 倍相关 [ 73]。该生物标志物的主要优势之一是邻近正常尿路上皮的突变频率非常低，在炎症（例如 BCG 后）或感染性疾病状态下通常检测不到。这使它成为监测期间的有用标志物，尽管需要对更大规模的队列进行研究来证明用这种生物标志物取代细胞学检查是合理的[ 77 ]。TERTp 突变目前已包含在商业测试中，例如 Uromonitor、AssureMDx 和 UroSEEK 检测。

成纤维细胞生长因子受体 3

大约一半的膀胱癌患者和大约 60%-70% 的低级别肿瘤患者可检测到 FGFR3 突变 [ 78 ]。作为一项独立检测，FGFR3 对膀胱癌的初始检测灵敏度为 39% [ 79 ]。在监测期内，尿液中存在 FGFR3 突变可预测复发，灵敏度为 70%，特异性为 87%。检测结果呈阳性的患者复发时间明显短于检测结果呈阴性的患者 [ 79 ]。在 200 名浅表低级别肿瘤患者中，检测伴随复发的灵敏度为 58%，而检测结果呈阳性的患者随访期间复发风险增加四倍 [80 ]。FGFR3 突变可能有助于识别预后良好、进展风险低的患者，因为 FGFR3 突变型新发肿瘤往往比 FGFR3 野生型新发肿瘤患者的复发性肿瘤处于较低的分期和等级[ 81 ]。沿着这一思路，一项针对 70 例患者的决策分析研究（马尔可夫模型）发现，基于 FGFR3 突变状态的部分替代膀胱镜检查的改良监测方案比标准监测更安全、更具成本效益。患者大多患有 Ta/1 级肿瘤，中位随访时间为 8.8 年[ 82 ]。

极光激酶A

极光激酶 A (AURKA) 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在有丝分裂中起重要作用，在包括 BC 在内的多种癌症中过表达 [ 83 ]。AURKA 过表达与不良临床结果相关，并归因于细胞周期进展加快和非整倍体基因组不稳定性 [ 83 ]。AURKA 还可以预测肌层浸润性 BC 患者对新辅助顺铂化疗的耐药性 [ 84]。此外，AURKA 可能调节细胞侵袭和转移。最近使用组织微阵列对 423 例膀胱癌进行的分析表明，AURKA 的过表达与 AURKA 下游调控基因（例如转录因子 PAX-3）的表达特征相结合，在基底亚型肿瘤中富集，这些肿瘤具有高度侵袭性[ 85 ]。可以通过 FISH 或 RT-PCR 检测尿液中的 AURKA。FISH 检测尿路上皮细胞中的 AURKA 拷贝数，对膀胱癌检测的敏感性和特异性分别为 80% 至 97% 和 80% 至 87%[ 86 , 85]。一项研究使用 RT-PCR 对血尿患者的排尿样本进行检测，结果显示敏感性为 84%，特异性为 65%。与细胞学检查相比，这种生物标志物在检测低度病变方面的准确度更高[ 87 ]。一项研究比较了 AURKA 的 FISH 与 UroVysion，结果显示后者在检测和监测膀胱癌方面同样有效，但成本更低[ 88 ]。需要更多前瞻性研究来支持使用 AURKA 作为检测和监测膀胱癌的生物标志物，而且就目前情况而言，它不能完全取代细胞学检查。

表观遗传生物标志物DNA甲基化

与衰老和环境暴露的累积效应相关的 DNA 甲基化改变在 BC 的致癌作用和进展中起着重要作用。基因启动子内富含 GC 的区域（称为 CpG 岛）的过度甲基化会导致肿瘤抑制基因沉默 [ 89 ]。或者，DNA 甲基化的整体丧失（低甲基化）会导致基因表达异常。DNA 甲基化变化在化学上是稳定的，可以通过尿液中脱落的无细胞 DNA 片段和肿瘤细胞进行量化 [ 90 ]。第一项证明尿液 DNA 甲基化检测可用于 BC 诊断可行性的研究显示，包括 RARβ、DAPK、E-cadherin 和 p16 在内的一组检测的敏感性为 91%，特异性为 76% [ 91]随后，众多研究报告了 100 多种基于甲基化的标记物 [ 92 ]。趋势是通过继续测试不同的组合而不是单个组合来提高基于甲基化的检测相对于细胞学的灵敏度和特异性。在检测环境中，包括组合标记在内的检测组的灵敏度和特异性分别为 52% 至 100% 和 60% 至 100% [ 89 , 90: POU4F2 和 PCDH17 组合的敏感性和特异性分别为 90% 和 94%，受试者工作特征曲线下面积 (AUC) 为 0.92。一项以良性泌尿系统疾病患者为对照的前瞻性多中心研究显示，NID2 和 TWIST1 基因组合的敏感性为 90%，特异性为 93%。有趣的是，两项评估这两个基因的后续前瞻性研究未能重复原始研究中观察到的高诊断性能，敏感性和特异性分别为 58-75% 和 61-71% [ 93,94 ] 。此外，之前的 BCG 治疗似乎影响了小组的准确性，而目前吸烟的患者灵敏度有所提高 [ 94]。UroMark 检测法是最近开发的，用于对血尿患者进行膀胱癌的初步检测。靶向亚硫酸盐测序用于开发 150 个 CpG 位点的甲基化特征，涵盖广泛的等级和阶段。该检测法在两个独立组中进行了验证，灵敏度为 98%，特异性为 97%，AUC 为 0.97 [ 95]。目前正在进行两项前瞻性观察研究 DETECT I (NCT02676180) 和 DETECT II (NCT02781428)，以验证该检测在检测和监测环境中的使用。支持在监测环境中使用 DNA 甲基化标记的数据也很有希望。一项长达 7.4 年随访的前瞻性研究表明，SOX1、IRAK 和 L1-MET 的组合对检测疾病复发的敏感性为 80%，特异性为 97%，AUC 为 0.90 [ 96]。包含 CFTR、SALL3 和 TWIST1 的组合与细胞学检查相结合，对复发性肿瘤的检测灵敏度有所提高（97%）。仅对组合检测呈阳性的患者进行膀胱镜检查，估计可减少 36% 不必要的膀胱镜检查，且不会漏掉高级别肿瘤 [ 97 ]。总体而言，目前缺乏 DNA 甲基化生物标志物之间的对比试验，也缺乏通过更大规模的前瞻性研究进行外部验证。技术差异（例如焦磷酸测序与定量甲基化 PCR）也导致基于甲基化的生物标志物的性能特征存在显著差异，阻碍了它们在临床中的应用。

微小RNA

微小RNA（miRNA）是小型单链非编码RNA（约含22个核苷酸），通过与mRNA分子内的互补序列碱基配对来影响基因转录。这种相互作用通过干扰复合物的形成或mRNA的降解（类似于小干扰RNA）来抑制翻译[ 98 ]。miRNA可以在尿液中以游离循环分子、与核糖核蛋白复合物结合或细胞外囊泡（如外泌体）的形式被检测到[ 99 ]。这些分子是乳腺癌检测和预后的有吸引力的靶点，因为癌症中miRNA表达的变化表现出组织特异性和高检测水平[ 90 ]]。此外，由于其长度较短，与其他核酸相比，它们更耐核酸酶降解。这简化了样品的初始处理，因为材料可以在室温下储存长达 48 小时 [ 100通过 miRNA 阵列或新一代测序检测靶点，然后通过 RT-PCR 进行定量分析，以指示相对于非癌症对照的表达增加或减少。多种 miRNA 已被鉴定为有前途的尿液生物标志物。当分析包括多个靶点而不是单个靶点时，灵敏度和特异性会提高。最早的一项研究表明，与健康捐赠者相比，乳腺癌患者尿液中的 miR-126:miR-152 和 miR-182:miR-152 比率明显较高。miR-126:miR-152 miRNA 比率的灵敏度最高，为 72%，特异性最高，为 82%，AUC 为 0.77 [ 101]。另一项研究进行了全局 miRNA 表达谱分析，并确定了六个 miRNA 诊断特征，其对初步诊断的敏感性为 85%，特异性为 87%，AUC 为 0.92（miR-18a、miR-25、miR-187、miR-140-5p、miR-142-3p、miR-204）[ 102 ]。一项类似的研究确定了一个 25 个 miRNA 的诊断预测模型，估计敏感性、特异性和 AUC 分别为 87%、100% 和 0.92。将模型限制为 15 和 10 个 miRNA 会导致一些性能损失，但揭示了 miRNA（miR-140-5p、miR-199a-3p、miR-93、miR-652、miR-1305、miR-224、miR-96、miR-766）对所有模型的贡献始终如一 [ 98一些 miRNA 也被证明可用于区分高级别和低级别肿瘤，单独使用 miR-125b 或与 miR-92a 联合使用时，其敏感性、特异性和 AUC 分别为 81-85%、74-87% 和 83% [ 102 , 103]。支持在监测期间使用 miRNA 的数据不太可靠。一项使用 12 个 miRNA 的小型研究显示，在一个接受独立验证的监测队列中，灵敏度高 (88%)，但特异性低 (48%)。然而，在 T1 期 (AUC = 0.93) 和高容量疾病 (AUC = 0.81) 中，性能最高。在这种情况下，需要更多验证前瞻性研究。此外，尿液收集的标准化很重要，因为它已被证明会影响 miRNA 面板的整体性能。在使用尿液上清液中的无细胞 DNA 而不是全尿液或尿液沉淀物的研究中观察到了最高的灵敏度 [ 100这在血尿的情况下尤其重要，因为血尿中裂解的红细胞可能会释放出 miRNA，从而导致对膀胱组织中失调的 miRNA 的干扰和不准确的测量[ 99 ]。

转录组生物标志物

使用 RT-PCR 结合多种 RNA 扩增技术（例如金纳米粒子）测量 mRNA，可以检测到尿液中的 mRNA，尽管这些 mRNA 大多被 RNases 降解。mRNA 是一种有吸引力的生物标记，因为它们反映了 BC 患者与健康个体不同的活跃细胞内过程。例如，尿液泛素结合酶 E2C (UBE2C) 和异亮氨酸谷氨酰胺基序 GTPase 活化蛋白 (IQGAP3) mRNA 水平在 BC 患者中明显高于健康对照者（包括血尿患者）[ 104]。mRNA 检测在单个和多个目标组合中的表现差异很大。值得注意的是，多个目标或单个目标与细胞学检查的组合已被证明可以提高主要检测环境中的表现。总体而言，多目标组合的敏感性为 36–97%，特异性为 82–100%，AUC 为 0.86–0.95 [ 64 ]。S100 钙结合蛋白 A4 (S100A4) 编码一种刺激血管生成的蛋白质，其敏感性和特异性分别为 90% 和 92%，AUC 为 0.978。随着分期和分级的增加，阳性率较高，与细胞学检查相结合可将该生物标志物的敏感性提高到 97%，但特异性降低到 80% [ 105碳酸酐酶 IX (CAIX) 是癌细胞中高表达的基因，它有助于细胞适应肿瘤微环境中的酸性条件[ 106 ]。它在独立队列中被证实可用于检测肿瘤，灵敏度和特异性分别为 81% 和 96%。预测准确度也显著高于细胞学检查，特别是在低级别肿瘤中（88.3% vs. 67.4%）。有趣的是，与 S100A4 相比，CAIX 的 mRNA 水平随着肿瘤分期和分级的增加而降低。CAIX 还被证明与更高的疾病复发风险相关，尽管其在监测环境中的预后效用尚未得到验证[ 107]。一项前瞻性、盲法、多中心研究已对包括胰岛素样生长因子 2 (IGF2) 和 MAGE-A3 在内的基因表达特征进行了外部验证，以用于检测。该测试的灵敏度达到 81%，特异性达到 91%，AUC 达到 0.94。MAGE-A3 是一种肿瘤特异性蛋白，在 43% 的膀胱癌中表达 [ 108]。最近的研究集中于开发多 mRNA 特征以帮助进行风险分层和预后。值得注意的是，包括原癌基因叉头框 M1 (FOXM1)、S100 钙结合蛋白 A8 (S100A8) 和其他与分期增加和生存率降低有关的基因在内的 13-mRNA 特征优于之前发表的 mRNA 特征。在将年龄和分级纳入列线图的情况下，它在预测疾病进展方面的 AUC 达到 0.90。与其他基于核酸的测试类似，评估新型基于 mRNA 的生物标志物的研究目前缺乏外部验证，并且在检测开发和对照组选择方面存在差异，这限制了它们的可重复性和在现实环境中的实施。

炎症生物标志物

宿主免疫反应会影响肿瘤的发展、治疗效果和肿瘤进展。因此，人们对识别疾病特异性炎症生物标志物产生了浓厚的兴趣，这些标志物既可用于诊断，也可用于膀胱内治疗后的监测。尿液和/或血液中检测到的尿路上皮中几种细胞因子的表达失调与癌症的发生和发展有关。这些包括 TNF-alpha 基因启动子表达增加和基因多态性增加；TGF-beta 表达增加；白细胞介素 (IL) 1B、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和 IL-18 表达增加；IL-16 表达减少 [ 109]。在一项包括血尿患者的研究中，IL-13 和热休克蛋白 60（一种蛋白质伴侣）共同产生 0.95 的 AUC 来检测膀胱癌。炎症生物标志物在预测 BCG 反应和复发方面表现出最大的潜力。例如，IL-6/IL-10 比率可预测高危患者的 BCG 反应和无复发生存期，尽管 CIS 患者被排除在外 [ 110 ]。值得注意的是，一项前瞻性研究连续测量了接受 BCG 治疗的患者尿液中的细胞因子，并根据 9 种细胞因子（IL-2、IL-8、IL-6、IL-1ra、IL-10、IL-12(p70)、IL-12(p40)、TRAIL 和 TNF-α）构建了列线图，该列线图预测复发可能性的准确率为 85.5%（95% CI 77.9–93.1%）[ 111]。尽管这些研究目前缺乏外部验证，但它们凸显了炎症生物标志物日益增长的重要性。在当前免疫检查点抑制和其他新型免疫疗法正在改变非肌肉浸润性乳腺癌治疗模式的时代，炎症标志物的研究和使用越来越重要。

代谢生物标志物

可以使用液相色谱和质谱法从尿液中获取代谢组学特征。鉴于样本采集的非侵入性以及样本处理的简易性，这对于开发用于膀胱癌检测的生物标志物具有吸引力。代谢特征是癌症特异性的，可以从良性血尿中的代谢特征中辨别出来[ 112 ]。到目前为止，代谢组学研究仍然专注于早期癌症检测。总体表现相对较高，包括三种或更多种代谢物的面板的 AUC 范围为 0.81 至 0.99[ 64 , 113]性别和年龄会影响尿液中检测到的代谢物的个体间差异，因此在发现队列选择中纳入这些因素非常重要[ 112]。一项研究最近使用性别和年龄匹配的队列比较了低级别和高级别膀胱癌（伴有或不伴有血尿）的代谢特征。在外部验证集中，代谢组对区分癌症患者和对照组的灵敏度、特异性和 AUC 分别为 81%、82% 和 0.84。当从 74 个代谢物组中选出性能最高的 5 种代谢物时，区分低级别和对照组的 AUC 为 0.90。区分低级别和高级别疾病的性能总体较低，血尿患者的 AUC 为 0.83，无血尿患者的 AUC 为 0.76 [ 114]。关于使用代谢特征进行监测和预后的数据有限。有趣的是，最近的一项小型研究测量了患者在 TURBT 之前和之后的代谢特征变化，并注意到 TURBT 之前和之后的代谢特征发生了统计学上显着的变化。随后的纵向分析显示，代谢特征逐渐向 TURBT 之前转变，并且在一个案例中，它预测了膀胱镜检查的结果，从而支持在监测环境中临床使用代谢特征[ 115 ]。代谢标志物的验证和未来实施的总体挑战在于个体间和个体内测量值的差异性，这种差异是由水摄入量、饮食、药物摄入量和环境暴露等混杂因素造成的。

组合生物标志物

随着新一代测序、计算生物学和机器学习的进步，跨多个组学类别的生物标志物正在不断被发现。这反映了人们对乳腺癌中显著的肿瘤异质性的认识日益加深，并促使研究人员将多组学生物分子整合到测试组中，以提高癌症患者诊断和预后预测的准确性 [ 116 , 117 ]。这种方法是 AssureMDx 等商业测试的基础，过去 10 年中发布的其他新型生物标志物显示出 90% 或更高的检测灵敏度和特异性 [ 64一项前瞻性盲法研究纳入了 475 名肉眼血尿患者，研究内容包括 TERT 和 FGFR3 突变与 SALL3、ONECUT2、CCNA1、BCL2、EOMES 和 VIM 甲基化。灵敏度、特异性和 AUC 分别为 97%、77% 和 0.96。NPV 为 99%，表明该检测在分类适合膀胱镜检查的患者方面发挥了作用。值得注意的是，在 99 名膀胱镜检查前后尿液样本的 DNA 检测结果均为假阴性的患者中，有 3 名患者的肿瘤所有生物标志物检测结果均为阴性[ 72 ]。A 发表了一系列关于将细胞学与不同的蛋白质和转录组学靶点（survivin、透明质酸酶和基质金属蛋白酶 2 和 9）相结合的单个检测组的报告，其灵敏度为 83-95%，特异性为 83-98% [ 118，119 ]。HYAL1（蛋白质）、长链非编码 RNA-尿路上皮癌相关 1（mRNA）、miR-210 和 miR-96 的蛋白质表观遗传组合显示敏感性为 100%，特异性为 89%，ROC 为 0.98[ 120 ]。这些研究为病例对照研究，尚未经过外部验证。

结论

得益于新一代测序、蛋白质组学、生物信息学和数学建模的进步，用于检测和监测 BC 的新型尿液生物标志物的开发取得了重大进展。目前已有多种基于细胞和蛋白质的检测方法可供商业化使用；然而，由于大多数研究中假阳性率较高且存在异质性，临床医生对此持怀疑态度，因此这些检测方法仍未得到国家和国际指南的充分认可。总体而言，商业检测方法比细胞学方法灵敏度高但特异性低，因此不能用作独立检测方法。较新的标志物在检测和监测方面均表现出优于细胞学方法的高性能，但绝大多数在前瞻性研究中缺乏外部验证。头对头研究也几乎不存在，这限制了它们在研究环境之外的广泛应用。其他未解决的问题包括样本处理和实验室方法缺乏标准化（无细胞 DNA 与沉积物 DNA、测序流程等），以及在确定异质性人群的检测阈值方面存在差异。临床医生面临的最大挑战是选择适合当前临床情况的“最佳”生物标记物，同时了解潜在的混杂患者变量（例如慢性炎症）和风险。尽管如此，通过组合生物标记物捕捉尿路上皮肿瘤的异质性，有很大的潜力可以提高测试性能，这反过来又允许在多个护理环境中采用个性化方法。