背景介绍

报告基因是指在细胞、组织、器官或个体中表达的易于检测的基因。作为报告基因，必须满足的条件是其表达产物在受体细胞中无本底表达，且表达产物易测量。

图1 报告基因系统，可用组成型或诱导型启动子驱动报告基因 (Serganova & Blasberg, 2019)。

CAT 基因

第一个报告基因系统用于表征启动子的活性——将启动子元件连接到氯霉素乙酰转移酶CAT 基因前 (Shaw et al., 1979)，把构建成功的质粒转染至靶细胞，将14C-氯霉素添加至培养基中，检测提取物中乙酰化和非乙酰化14C-氯霉素的放射性，由此计算出酶活以表征启动子的活性 (An et al., 1982) 。

图2 在CEF细胞中分别转染PSV2cat和pRSVcat两种质粒并检测CAT酶活，发现在后者的实验条件下CAT酶活性更高 (An et al.,1982)。

GUS 基因

Jefferson在博士期间开发了基于β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS，EC 3.2.1.31）的可视化报告系统(Jefferson et al., 1986, Jefferson et al., 1987)，GUS由大肠杆菌K-12的GUS基因编码。

GUS的组织化学法检测：这种酶与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）一起孵育时，会将X-Gluc代谢为蓝色产物。Jefferson将这种组织化学法应用于植物，因为在高等植物中没有可检测到的GUS活性(Jefferson et al., 1987)。随后，数以万计的实验室在植物生物学研究中使用了GUS报告系统，并一直延续至今。

GUS的分光光度法检测：GUS能与底物4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷（MUG）反应并产生荧光物质4-甲基伞型酮（MU），MU的激发波长为365nm、发射波长为456nm，可由分光光度计或酶标仪测出(Jefferson et al., 1987)。

图3 分光光度法检测GUS (Jefferson et al., 1987)。131指转入pBI131载体（驱动GUS基因的是rbcS启动子）的材料，121指转入pBI121载体（驱动GUS基因的是CaMV 35S启动子）的材料。

LacZ 基因

LacZ基因编码大肠杆菌水解酶β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal），β-gal可将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝 (An et al., 1982)，其作为报告系统被广泛应用于细菌、酵母、哺乳动物细胞中。

蓝白斑筛选是一种利用此报告系统来筛选重组子的方法。使用可编码β-gal ω片段的菌株作为宿主，使用可编码β-gal α片段的质粒作为空载，其多克隆位点（MCS）位于编码α肽链的区域内，因而当空载转入宿主菌中，α片段和ω片段互补形成具有酶活性的β-gal，在加入X-gal的培养基上，菌斑呈蓝色，而由于目的基因的插入会破坏α片段，不能形成具有酶活性的β-gal，因而重组子呈现白色。

图4 蓝白斑筛选原理图。图片来源：DAWINBIO。

GFP 基因

绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）最早是从水母（Aequorea victoria）中分离出来的 (Shimomura et al., 1962)，它包含了238个氨基酸，可在激发光下发出绿色荧光。它最令人惊讶的地方在于，其荧光发色团是自发形成的（由Ser65-Tyr66-Gly67三肽自催化形成p-羟基苯亚甲基咪唑酮所生成），不需要额外的底物、酶以及辅助因子，这意味着该蛋白可以直接在任何生物体中表达并发光，因此，GFP迅速成为细胞生物学、分子生物学中研究与应用最为广泛的蛋白之一。科学家Roger Y. Tsien、Osamu Shimomura和Martin Chalfie也因为发现和改造GFP蛋白而获得了2008年的诺贝尔化学奖。

图5 GFP最初来源于维多利亚水母（Aequorea victoria）。图片来源：WIKIPEDIA。

图6 各种荧光蛋白。图片来源：WIKIPEDIA。

表1 几种常见的荧光蛋白及其相对于野生型GFP的突变位置。

图7 转入了GFP的生物，分别为秀丽隐杆线虫、果蝇、兔子、油菜、小鼠、斑马鱼、HeLa细胞、果蝇胚胎细胞、拟南芥下胚轴细胞、小鼠Purkinje细胞 (Chalfie, 2009)。

荧光素酶

▲萤火虫深深根植于我国文化中，既有“囊萤映雪”的美谈流传，也有“银烛秋光冷画屏，轻罗小扇扑流萤”的佳作流传。

▲黑暗中的蘑菇。图片来源：Origami-Tumblr。

荧光素酶（Luciferase，Luc）是对所有能够产生生物荧光的氧化酶的统称，与荧光蛋白发光的机制不同，荧光素酶不需要外部光源，但需要添加被称为荧光素的底物。

图8 生物荧光和荧光蛋白发光的区别。生物荧光是指荧光素+ATP+氧气在荧光素酶、Mg2+的催化作用下生成几种物质和光，荧光蛋白发光是被激发光源激发后电子被激发到高能级，随后跃迁至低能级的过程发出比激发光波长更长的荧光。

最为人所知的发光生物是萤火虫，其次是真菌例如蘑菇、细菌及一些藻类等。目前被充分研究的荧光素酶是来源于萤火虫（Photinus pyralis）的荧光素酶以及来源于海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶。对荧光素酶应用最广泛的实验是双荧光素酶报告基因检测实验，小远将在后文作具体介绍。

图9 分别来自萤火虫、细菌和鞭毛藻的荧光素酶。

RUBY 基因

对GUS进行检测或染色需要添加底物4-MUG或X-Gluc，观察GFP等荧光蛋白需要荧光激发，检测荧光素酶需要添加底物荧光素，很多时候样品会因为检测或观察而遭到损毁，那有没有无创、连续且肉眼可视的报告系统呢？

在甜菜、火龙果中看到的鲜红色是甜菜红色素累积的结果，而甜菜红色素的生物合成已被研究的十分清楚，只需要三个酶促反应即可将酪氨酸转化为甜菜红色素。在双元载体T-DNA上插入含有这三个酶的阅读框（简称为RUBY），代替真核抗性筛选基因，即可用红色来表征转基因阳性愈伤或植株 (He et al., 2020)。

图10 将三个甜菜红色素的生物合成基因融合成一个开放阅读框，只使用一个启动子和终止子，每个基因之间插入2A肽，蛋白在翻译后，2A肽会进行自剪切，释放出三个酶 (He et al., 2020)。

图11 使用RUBY系统的转基因植株及愈伤等 (He et al., 2020)。（a）CaMV 35S启动子驱动RUBY系统，右侧为转基因拟南芥；（b）UBIQUITIN启动子驱动RUBY系统，右侧为转基因拟南芥；（c）种子特异性启动子At2S3驱动RUBY系统，在叶和茎中无RUBY表达，而种子中有RUBY表达；（d）YUC4:RUBY植株在雌蕊的叶尖和顶端显示红色；（e）DR5:RUBY在水稻愈伤组织中表达；（f）与e做对照的DR:eGFP；（g-h）DR5:RUBY与DR5:eGFP的水稻根、叶的对比图。

TWO

关于报告基因的一些反常识发现

随着一些报告基因例如GFP被广泛应用于分子及细胞生物学中，许多团队开始研究报告基因对受体细胞的影响。最早的一篇研究结果显示三种常见的野生型GFP突变体会促进细胞凋亡 (Liu et al., 1999) 。在内皮细胞中，GFP本身可以选择性地诱导某些基因在内皮细胞中的表达，例如检测到GFP以剂量依赖的方式诱导HSP70在转录水平和蛋白水平上的表达 (Zhang et al., 2003) 。在大鼠心肌细胞中，GFP的过表达被发现会影响心肌细胞的收缩功能 (Nishimura et al., 2006) 。增强型GFP（eGFP）在肌肉细胞中的表达会损害其收缩特性，这是因为eGFP会结合肌球蛋白头部，从而干扰肌动蛋白-肌球蛋白相互作用，进而干扰肌肉细胞的收缩功能 (Agbulut et al., 2007)。。在神经元中，由神经元特异性启动子thy1驱动的黄色荧光蛋白（YFP）的表达会改变神经元的细胞特征 (Comley et al., 2011)。使用全基因组DNA微阵列技术研究了GFP对心肌细胞的影响，结果显示212个基因的表达发生改变，其中174个基因上调、38个基因下调 (Badrian & Bogoyevitch, 2007)。分析GFP稳定表达后对乳腺癌细胞蛋白质组的影响时发现，GFP很可能对细胞骨架的结构、细胞应激反应等产生影响 (Coumans et al., 2014) 。

在植物领域中，似乎极少对报告基因进行毒性研究。小远在工作中曾被不少老师问过是否能直接使用亚细胞定位载体直接做转基因过表达实验，小远会建议在未确定基因功能之前不要使用带有荧光蛋白或其他报告基因的载体做转基因过表达实验，以免报告基因影响目的蛋白的正常功能；如果已经确定了基因功能，带有报告基因的载体可以用于瞬时转化或稳定转化中，以方便后续更深入地研究基因功能，例如可用于蛋白互作检测中的Co-IP实验。

图12 使用Co-IP技术检测RRS1与RPS4、RRS1B与RPS4B的相互作用 (Saucet et al., 2015)。这里小远也插播一个我们在做客户实验时经常发现的现象：在Co-IP实验中发现使用GFP抗体会IP到多种蛋白（正如图中右侧的2、3、5、6道泳道），这是目的基因与GFP相连后融合蛋白发生了断裂。

小远需要提醒大家，在基因功能研究中，将转入GFP等报告基因的受体细胞/组织作为对照的实验结果一定要谨慎对待；在不确定基因功能之前，谨慎使用带有报告基因的载体作为转基因载体。虽然在某些情况下有对报告基因会产生毒性的一些担忧，但其仍然是最可靠且最易使用的生物学研究方法之一。

THREE

报告基因在实验中的应用

亚细胞定位——以荧光蛋白作为报告基因

亚细胞定位实验，构建目标基因与荧光蛋白的N端或者C端融合的载体，采用瞬时转化技术，利用激光共聚焦显微镜（Confocal microscopy）观测某种蛋白在细胞内的具体位置，例如在细胞核内、细胞质内、细胞膜或细胞器上。亚细胞定位实验包括普通定位实验、共定位实验以及BiFC实验等。

图13 在原生质体中观察蛋白的亚细胞定位情况 (Liu et al., 2020)。

图14 我司亚细胞定位空载pBWA(V)HS-gfp，载体内留有两个BsaI酶切位点，可无缝连入目的基因。

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伯小远

闪亮的GFP#GFP#报告基因

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组织表达分析——以GUS 作为报告基因

将目的基因的启动子与GUS报告基因相连，根据组织染色的结果可判断基因表达的时空性和启动子的表达强度。

图15 GUS作为报告基因分析基因在不同组织的表达模式 (Qin et al., 2011)。

图16 我司启动子分析空载pBWA(V)H-gus，GUS基因5’端留有酶切位点，可连入目的基因的启动子。

酵母双杂——以ADE2、HIS3、AUR1-C、MEL1作为报告基因

酵母双杂交是一个强大的工具，在大多数生物中被广泛应用于破译基因功能和信号通路。该方法兴起于20世纪90年代，酵母双杂交是基于观察到真核生物转录因子有两个可分离的结构域，DNA结合结构域（Binding domin，BD）和激活结构域（Activating domain，AD）。DNA结合域负责转录因子在特定DNA序列上的结合，激活域的功能则是激活基因的转录。BD和AD并非一定要存在同一蛋白质中才能发挥功能，这两个结构域在物理上是可分离的，当两个结构域非常接近时，目标基因的转录激活也会发生。由此，通过检测报告基因的激活表达情况来表征蛋白质之间是否存在相互作用。

图17 我司酵母单杂交的bait载体。

图18 我司酵母双杂交的prey载体。

图19 我司酵母双杂交项目交付图。

酵母单杂——以AUR1-C 作为报告基因

酵母单杂的原理与双杂类似，将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与靶序列相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。

图20 酵母单杂原理。

图21 我司酵母单杂交的bait载体。酵母单杂交的prey载体同双杂交的prey载体。

图22 酵母单杂实验证明，AaTCP14能够结合DBR2和ALDH1启动子上的TCP结合位点（Ma et al., 2018）。

双荧光素酶报告基因检测系统——以荧光素酶作为报告基因

双荧光素酶报告基因检测系统（Dual luciferase reporter assays）：在单荧光素酶检测系统（只有萤火虫荧光素酶）的基础上引入了海肾荧光素酶基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

图23 双荧光素酶报告基因检测实验流程。

适用实验

1、验证miRNA同mRNA靶向互作：将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。同样原理也可验证miRNA同lncRNA之间的靶向互作。

图24 我司验证microRNA与mRNA靶向互作时的载体构建原理图。图片来源：伯远生物。

图25 我司验证microRNA与lncRNA靶向互作时的载体构建原理图。图片来源：伯远生物。

2、验证启动子活性：将待测启动子构建至荧光素酶基因的上游，检测启动子的活性。同样，也可以将启动子区域分段截短或突变，再检测启动子活性。

图26 我司验证启动子活性或启动子截短或突变后的活性时的载体构建原理图。图片来源：伯远生物。

3、验证特定转录因子同其调控序列的互作：将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高或降低萤光素酶活性。

图27 我司验证特定转录因子同其调控序列的互作时的载体构建原理图。图片来源：伯远生物。

图28 我司双荧光素酶报告基因检测实验空载，可连入待测启动子序列。

图29 我司双荧光素酶报告基因检测实验空载，可连入待测转录因子序列、待测miRNA序列。

图30 我司双荧光素酶报告基因检测实验空载，可连入待测mRNA的3’UTR序列。

图31 利用双荧光素酶报告基因实验验证转录因子AabHLH112分别与启动子pAaERF1、 pADS、pCYP71AV1、pDBR2和pALDH1之间的相互作用(Xiang, 2019)。

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伯小远

双“剑”合璧#荧光素酶#报告基因#检测

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▲点击了解双荧光素酶实验系统原理

荧光素酶蛋白互作分析——以荧光素酶作为报告基因

荧光素酶蛋白互作分析实验（Luci-ferase Complementation Assay, LCA）以荧光素为底物来检测荧光素酶的活性。具体而言，生物体来源的荧光素酶催化底物萤光素发生氧化，发出最强波长在560nm左右的生物荧光。实验中，荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段，即NLuc和CLuc。在一个实验体系中，待检测的两个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合，如果两个目标蛋白相互作用，则荧光素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装，从而发挥荧光素酶活性，即分解底物产生荧光。

图32 荧光素酶蛋白互作分析实验的原理。

图33 荧光素酶蛋白互作分析实验检测APC10与DMS3及其突变蛋白的相互作用(Zhong et al., 2019)。

图34 我司荧光素酶蛋白互作分析中与目的蛋白A相连的nLuc载体图谱。

图35 我司荧光素酶蛋白互作分析中与目的蛋白B相连的cLuc载体图谱。

伯小远叨叨

在本文中，小远主要讲了报告基因的主要类型、反常识知识以及在平时实验中的应用，希望能对大家有所帮助！

一起来学习精选文章吧~

References

Agbulut O, Huet A, Niederlander N, Puceat M, Menasche P, Coirault C, 2007. Green fluorescent protein impairs actin-myosin interactions by binding to the actin-binding site of myosin. J Biol Chem 282, 10465-71.

An G, Hidaka K, Siminovitch L, 1982. Expression of bacterial beta-galactosidase in animal cells. Mol Cell Biol 2, 1628-32.

Badrian B, Bogoyevitch MA, 2007. Changes in the transcriptional profile of cardiac myocytes following green fluorescent protein expression. DNA Cell Biol 26, 727-36.

Chalfie M, 2009. GFP: Lighting up life. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 10073-80.

Comley LH, Wishart TM, Baxter B, et al., 2011. Induction of cell stress in neurons from transgenic mice expressing yellow fluorescent protein: implications for neurodegeneration research. PLoS One 6, e17639.

Coumans JV, Gau D, Poljak A, Wasinger V, Roy P, Moens P, 2014. Green fluorescent protein expression triggers proteome changes in breast cancer cells. Exp Cell Res 320, 33-45.

He Y, Zhang T, Sun H, Zhan H, Zhao Y, 2020. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Hortic Res 7, 152.

Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D, 1986. beta-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 8447-51.

Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW, 1987. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6, 3901-7.

Liu HS, Jan MS, Chou CK, Chen PH, Ke NJ, 1999. Is green fluorescent protein toxic to the living cells? Biochem Biophys Res Commun 260, 712-7.

Nishimura S, Nagai S, Sata M, et al., 2006. Expression of green fluorescent protein impairs the force-generating ability of isolated rat ventricular cardiomyocytes. Mol Cell Biochem 286, 59-65.

Saucet SB, Ma Y, Sarris PF, Furzer OJ, Sohn KH, Jones JD, 2015. Two linked pairs of Arabidopsis TNL resistance genes independently confer recognition of bacterial effector AvrRps4. Nat Commun 6, 6338.

Serganova I, Blasberg RG, 2019. Molecular Imaging with Reporter Genes: Has Its Promise Been Delivered? J Nucl Med 60, 1665-81.

Shaw WV, Packman LC, Burleigh BD, Dell A, Morris HR, Hartley BS, 1979. Primary structure of a chloramphenicol acetyltransferase specified by R plasmids. Nature 282, 870-2.

Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y, 1962. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59, 223-39.

Zhang F, Hackett NR, Lam G, et al., 2003. Green fluorescent protein selectively induces HSP70-mediated up-regulation of COX-2 expression in endothelial cells. Blood 102, 2115-21.

Liu S, Liao LL, Nie MM, et al., 2020. A VIT-like transporter facilitates iron transport into nodule symbiosomes for nitrogen fixation in soybean. New Phytol 226, 1413-28.

Qin BX, Tang D, Huang J, et al., 2011. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane. Mol Plant 4, 985-95.