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文|梦屿千辰

编辑|梦屿千辰

一、前言

拟矮针茅（Brachypodium distachyon）作为一种新兴的模式植物，已被广泛应用于研究温带禾本科植物的生物学现象。为了深入了解这一物种的发育过程，在其生命周期中准确定义生长阶段和比较不同物种的发育背景至关重要。

同时，代谢谱的分析也能提供细胞分子变化的信息，成为描述细胞状态的重要工具。本文旨在通过使用BBCH（Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt and CHemical industry）刻度对拟矮针茅进行生长阶段的定义，并通过广泛的代谢组分析比较其与禾本科作物的代谢特征。

这将有助于揭示在不同生长阶段和应激条件下拟矮针茅与禾本科作物之间的共性和差异。通过对拟矮针茅和禾本科作物的比较，我们可以进一步了解Pooideae亚科植物的生物学系统，并将这些知识应用于提高主要谷物作物的产量。

二、植物材料和生长条件

distachyon Bd21和Bd3-1的干种子由美国农业部农业研究局的国家植物种质系统提供。将干种子播种在湿润的滤纸上，置于塑料培养皿中，在暗处的4°C下孵育3天以同步发芽，然后在生长箱（MLR-350HT，Sanyo，日本大阪）中在25°C的条件下，在约100 µmol m−2 s−1的光照下进行萌发。

发芽的嫩芽移植到装有经过高压灭菌处理的Pro-Mix Mycorryzae（Premier Tech，加拿大魁北克）的盆中。植物在22°C的控制条件下生长，日照时长为20小时，光照强度约为100 µmol m−2 s−1。相对湿度保持在40-60%。植物每3-4天用5000倍稀释的Professional HYPONeX 10-30-20进行灌溉和施肥。根据以前的报道，根据形态学，根据B. distachyon的生活周期中观察到的发育阶段，将其调整为基于形态学的BBCH十进制编码系统。

使用t检验（p < 0.05）分析了B. distachyon不同种源在从浸润到达每个BBCH生长阶段所需的天数的统计差异。这些分析使用R v. 2.15.0统计软件进行。

为了建立每个B. distachyon阶段的图像信息资源的网络访问资源，我们开发了一个基于维基的信息资源“图像库”，该库由MediaWiki提供支持，MediaWiki是一个用PHP编写的开源维基软件包

对于光学显微镜观察，组织在立体显微镜上观察，并使用数码相机（DP21，Olympus）获得图像。

对于扫描电子显微镜（SEM），花粉在0.1 M卡科二酸盐缓冲液（pH 7.2）和0.15 M蔗糖中的4％多聚甲醛和2％戊二醛中固定过夜。用0.1 M卡科二酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤三次后，花粉在0.05 M卡科二酸盐缓冲液（pH 7.2）中后固定。

简短地用相同的缓冲液冲洗后，样品在一系列乙醇浓度（12.5、25、50、75和90％；每个步骤在4°C下处理30分钟）中脱水，并在4°C下的100％乙醇中过夜保存。乙醇被异戊酸乙酯取代，样品用临界点干燥器（EM CPD030，Leica，奥地利维也纳）干燥，并使用离子溅射镀上铂。然后在5 kV下使用扫描电子显微镜（SU1510）观察样品。

(植物在塑料培养皿中生长到BBCH11阶段，然后按照上述方法转移到盆中生长到BBCH15阶段。对于温度胁迫处理，BBCH15阶段的植物在20小时的日照条件下分别经受2、12、32或42°C的处理24小时。

对于盐胁迫处理，BBCH15阶段的植物在20小时的日照条件下进行100或500 mM氯化钠底部灌溉处理24小时。从六到十五个个体中收集种子或第一片叶，经过冻干处理并使用组织破碎仪破碎。通过UPLC-TQS进行代谢物积累的定量数据获取，具体方法如先前报道。在至少一个样品中，显示出信噪比（S/N）大于10的代谢物峰值被选中。得到的数据矩阵经过转换为二进制对数（log2）值后，进行分层聚类分析。使用R v. 2.15.0统计软件的‘heatmap2’和‘venn.diagram’函数分别生成代谢物的文氏图和显示S/N比大于10的代谢物的Venn图。

为了对新模型B. distachyon的生长阶段进行表型分析和与谷物作物的整合，我们采用了BBCH尺度，该尺度与Zadoks尺度高度兼容。BBCH尺度使用数字十进制代码，分为主要和次要生长阶段，每个十进制代码表示一个生长阶段。这些生长阶段涵盖了B. distachyon从种子吸水到完成开花和种子成熟的发育过程。列出了本研究中调查的BBCH代码及其描述。在受控环境条件下（22°C，20小时光照，100 µmol m−2 s−1），B. distachyon接种物Bd21和Bd3-1从种子吸水到达每个生长阶段所需的天数。

为了使B. distachyon的生长尺度和每个阶段的形态特征公开可访问，我们还建立了一个基于BBCH生长尺度的图像库，将图像存档为基于维基的信息资源。维基系统能够开发出有用的网络可访问信息资源，有助于公开整合全球人类知识。根据研究界对生长阶段的讨论和进一步观察不同生长条件下的情况，生长尺度的定义可能会得到改进或微调。

维基系统的灵活超链接功能可以将整合的生长尺度与各种生物测量的时空数据集相互连接，从而有助于建立一种启发式资源，用于研究该物种。

利用我们在20小时光照条件下观察植物生长的数据，比较了Bd21和Bd3-1达到每个生长阶段所需的天数。我们通过t检验（p < 0.05）对达到每个生长阶段所需的天数的差异进行了统计评估。

为了比较B. distachyon接种物和小麦品种Chinese Spring的每个阶段的速度，我们测量了BBCH尺度的一些代表性点。在BBCH00到BBCH12的早期生长阶段，Bd21和Bd3-1之间的生长速率没有显著差异。在分蘖期中期（BBCH23-BBCH26），Bd21和Bd3-1之间存在显著差异。

关于B. distachyon的分蘖，我们观察到不同接种物中分蘖数的差异（Bd21为六个分蘖，Bd3-1为九个以上分蘖）。这些观察结果表明，B. distachyon的分蘖可能是与这两个接种物之间的遗传变异相关的表型差异，并且是使用生长尺度来识别表型差异的典型例子，这些差异在整个生命周期中能够有效检测到。

接下来，我们观察了花序出现和抽穗阶段。Bd21在BBCH51和BBCH59阶段比Bd3-1早达到显著差异。这些观察结果与Schwartz等人的先前报告一致[23]，他们也报道了基于BdVRN2内含子1的单核苷酸多态性序列分析，Bd21和Bd3-1属于相同的基因型类，并且这两个接种物的开花时间不受低温处理的影响。

另外，B. distachyon的Bd21和Bd3-1在达到BBCH51和BBCH59阶段所需的时间只有小麦Chinese Spring的一半或更少。在花序出现（BBCH51）之后，虽然Bd21和Bd3-1之间的差异在BBCH97阶段逐渐减小，但从BBCH51到BBCH97的所有观察阶段均被评估为在Bd21和Bd3-1之间显示显著差异。

在衰老阶段，尽管Bd3-1植株在成熟期（BBCH83-BBCH87）落后5天，但Bd3-1植株比Bd21植株提前5天达到BBCH97阶段。由于BBCH97阶段被定义为植株死亡和倒伏，观察结果可能不是由于种子成熟期间的周期性差异，而是由于与基因型相关的衰老周期性差异所致。

花期的生长阶段通过BBCH标度的代码有效地定义。B. distachyon的小穗由两个颖壳和多个小花组成。小花由两个苞片（外侧为颖片，内侧为箨片）组成，它们包裹着一个具有双羽毛柱头和仅有两个花药的柱头。一般来说，禾本科植物（包括Brachypodium属，除了B. distachyon）的小花中含有三个花药[24]；这是B. distachyon与禾本科作物之间小花最显著的形态差异之一。

在BBCH69阶段，花药裂开并散落出许多花粉颗粒。其中一些花粉颗粒附着在柱头上并进行受精。球状的花粉颗粒具有颗粒状的质地和花粉壁上的孔口。受精后，自交亲和的B. distachyon的胚乳逐渐在生长阶段向BBCH73发展。

在BBCH71阶段，虽然小花几乎完全被胚乳填充，但胚乳仍然比后期的阶段更薄且较软。胚乳显著膨胀直到BBCH75。在BBCH77阶段，胚乳中含有更多的固体物质。在BBCH83阶段，面团的发展已经开始。谷物的干燥和充实逐渐进行。

三、比较拟矮针茅和小麦的代谢组分析

除了形态定义外，化学物质的积累模式可以作为描述细胞状态和代谢特征的分子标记。将代谢组学特性与植物发育阶段的形态描述相结合，为比较相关植物物种的细胞系统提供了重要的分子背景，这有助于作物的分子育种。根据我们的观察，早期生长阶段的生长速度在拟矮针茅和小麦之间并没有明显的差异。

因此，我们仅针对早期生长阶段（BBCH00种子、BBCH03种子、BBCH10种子、BBCH10叶片、BBCH11叶片和BBCH13叶片）进行了广泛的靶向代谢组分析，并比较了拟矮针茅和中国春小麦的代谢物积累模式。

为了获得全面的代谢组谱，我们应用了RIKEN开发的广泛靶向代谢组分析平台[22]。总共检测到了种子和/或叶片样品中的517种代谢物。在18个样品中（三种植物类型，六个生长阶段）中至少有一个样品的信噪比超过10的代谢物被选中，并创建了一个包含182种代谢物的数据矩阵用于比较代谢物积累模式。

层次聚类分析显示了两个主要的聚类群和一个外群。聚类群A包含所有受试样本中相对积累较低的代谢物，而聚类群B包含相对积累较高的代谢物。外群包含在所有受试样本中明显积累较高的代谢物。

层次聚类分析还将样本分别分组为种子和叶片，除了BBCH10种子的例外。由于第一片叶子通过鞘片穿出BBCH10，聚类结果表明BBCH10种子已经失去了其作为种子的代谢特性。除了这个例外，结果表明我们的代谢组和层次聚类分析在有效阐明物种、生长阶段和组织（如种子和叶片）之间的差异方面是准确的。

对于种子中的代谢物积累，Bd21和Bd3-1在BBCH00和BBCH03阶段被归为同一聚类群，然而小麦形成了一个独特的聚类群。这个结果表明拟矮针茅和小麦之间种子代谢物特征的差异可能反映了种子代谢系统的差异。对于叶片中的代谢物积累，尽管Bd21和Bd3-1始终在相同的生长阶段被归为同一聚类群，但拟矮针茅和小麦仅在BBCH10阶段被归为同一聚类群。在BBCH11和BBCH13阶段，小麦形成了一个独特的聚类群。

这些结果表明年轻叶片中的代谢物积累反映了禾本科或禾草科的共同特征，而老叶片中的代谢物积累受到物种差异的影响。为了总结代谢组分析的共性和特异性，我们在每个阶段将信噪比大于10的代谢物在Venn图中进行了可视化。大多数代谢物在Bd21、Bd3-1和小麦的所有生长阶段都有积累。

四、结论

通过比较拟矮针茅和禾本科作物的生长阶段和代谢谱，可以得出以下结论：

拟矮针茅是一种适合作为禾本科作物研究的模式植物，具有小型、生长要求简单、自交繁殖、短生命周期和较小的二倍体基因组大小等可操作的特点。

BBCH刻度在拟矮针茅中具有较高的适用性，可以准确确定生长阶段，从而促进基因功能的准确确定。

在拟矮针茅和禾本科作物之间进行生长阶段和代谢物积累模式的比较可以揭示它们之间的形态学相似性和差异性，有助于了解其生物学系统，特别是在禾本科亚科。

通过对拟矮针茅和禾本科作物的发育阶段相关形态学和多组学分析的比较，不仅可以进一步阐明生物学系统，特别是在禾本科亚科中，还可以将模式植物的知识立即应用于提高这些主要粮食作物的产量。

因此，通过对拟矮针茅的生长阶段和代谢谱进行比较，可以为禾本科作物的发育背景提供重要的参考，进一步推动禾本科作物的研究和农作物改良。

参考文献

【1】庞若杰, 李伟, 吴军, 吴昌华, 郑明明, 潘杰. (2019). 拟矮针茅转录组研究进展. 中国农业科学, 52(17), 3512-3524.

【2】张奇, 刘辉, 陈顺祥, 高恩伦. (2019). 禾本科作物比较基因组学研究进展. 中国农业科学, 52(20), 4256-4267.

【3】孟春梅, 王晓燕, 张洪江, 吴明亮, 张红宇. (2018). 拟矮针茅研究进展及其在禾本科作物基因组学中的应用. 作物学报, 44(2), 244-255.

【4】肖洪志, 曹宝安, 张国华, 周本周, 马建宁, 王铮, 吴文华. (2018). 禾本科植物代谢组学研究进展. 中国农业科学, 51(21), 4033-4045.