文 |邻村胡大爷

编辑|邻村胡大爷

准确揭示物种养殖种群的来源和遗传组成，不仅有利于了解其遗传结构，更有利于其野生种群的保护和遗传资源的管理。

缺乏对养殖种群遗传背景的知识，可能导致不同野生种群，甚至物种在人为介导下发生遗传混杂，进而出现不同种群或物种间的基因污染。

尤其在珍稀濒危野生动物的保护实践中，具有不同遗传背景的种群在改善种质等的需求下被人为混杂而形成人工繁育种群，此时个体虽然形态上仍属同一物种。

但遗传上已经变为混杂状态，将它们再放归野外，可能污染甚至替代原有野生种群的纯正基因库，从而严重威胁物种遗传多样性的保护。

案例分析

国家二级保护动物中国大鲵是此现象的一个经典案例，基于基因组水平的全国大鲵野生种群和养殖种群的研究结果表明，大鲵养殖种群至少混杂了5个不同的现生种，且不同的养殖种群混杂了2个或多个物种。

该结果对大鲵的人工养殖、增殖放流及野生种群的保护均具有非常重要的意义，在鱼类中，大西洋鲑是最为著名的案例。

研究表明，自20世纪70年代以来，上千万吨的养殖大西洋鲑逃逸至野外并与不同地理种群形成杂交后代，严重威胁到野生大西洋鲑的产量、繁殖和遗传多样性。

唐鱼隶属于鲤形目鲤科唐鱼属，俗称白云金丝、白云山鱼、红尾鱼，分布于我国华南地区和越南东北部。

据信，唐鱼最早于1935年作为观赏鱼被带入美国，因来自中国，故名“唐鱼”，是为数不多的几种原产中国的世界性观赏鱼类之一。

由于唐鱼个体娇小(最大个体体长不超过30mm)、色彩鲜艳、价格实惠、且容易繁殖和饲养，目前全球许多国家和地区如新加坡、加拿大、英国、中国台湾等的观赏鱼市场都有它的身影。

而其模式产地广州白云山，自20世纪60年代后的20多年内，未再发现野生种群，因此唐鱼1988年被原农业部列为国家二级保护动物，随后被认为已野外灭绝。

自2003年以来，多个唐鱼野生种群相继在广东、海南、广西被发现，其濒危状态和等级也被重新评估，由野外灭绝降为极危。

自野生种群被重新发现后，相继有学者对唐鱼养殖种群和野生种群的形态差异、遗传多样性和遗传分化等开展了研究。

形态学研究结果表明，唐鱼野生种群和养殖种群差异极显著，而且在体型大小上有明显的差异。

唐鱼不同野生种群在形态上存在显著差异，且可能与地理隔离存在着某种相关性，针对唐鱼养殖种群和野生种群的遗传多样性，以及遗传分化等方面的研究，均揭示唐鱼野生种群遗传多样性较低，而养殖种群遗传多样性较高。

我们利用Cytb基因对唐鱼的5个野生种群和2个养殖种群的遗传多样性与遗传结构的研究结果表明，唐鱼野生种群的遗传多样性较低，每个种群都各自形成单系。

养殖种群与中国广东清远野生种群亲缘关系较近，基于2个线粒体片段、2个核基因和13个微卫星位点，对采自我国广东、广西、海南和越南的10个野生种群和3个养殖种群开展了遗传结构和遗传多样性研究。

结果表明，养殖种群起源于单一种群，养殖种群遗传多样性，比大多数野生种群的遗传多样性高，且与广州附近野生种群间的亲缘关系较其他野生种群近，不同野生种群间分化十分明显。

另外研究认为清远种群为放流的养殖种群，虽然该研究对养殖种群的起源提出了一个初步结论，但未能合理解释唐鱼养殖种群高遗传多样性形成的原因。

同时对于唐鱼养殖种群与广州附近野生种群的关系也未作深入探讨，此外对于清远种群来源于养殖种群这一重要结论亦未给出充分证据。

上述问题的存在给唐鱼养殖种群的管理和野生种群的保护带来了严竣挑战，目前在养殖唐鱼可以合法贸易的背景下，如何避免养殖种群和野生种群间的基因污染是一个十分重要的课题。

本研究通过分析已发表的唐鱼3个代表性养殖种群，以及广州附近4个野生种群的分子数据，拟回答以下科学问题:唐鱼养殖种群与广州附近现存4个野生种群的遗传关系，唐鱼养殖种群和野生种群之间的基因流大小以及方向，唐鱼清远种群与主要养殖种群的关系。

样品与数据收集

本研究所用分子数据均为已发表数据，该数据来自具有代表性的3个唐鱼观赏鱼市场和广州附近4个唐鱼野生种群。

本研究获取了上述样品的线粒体细胞色素b基因，2个核基因序列以及13个微卫星位点的分型数据。

相关数据均可通过GenBank获，深圳种群由于与广州附近野生种群地理距离较远，且已有研究表明其在系统发育上与养殖种群和广州附近野生种群互为姐妹群，因此仅作为系统树中的外类群。

从GenBank获取所有样品的fasta格式的数据后，导入ClustalX2.1程序进行序列比对，比对结果通过MEGAX软件，对可能存在的碱基错读、漏读和多读辅以人工校对。

随后利用软件中的Kimura’stwo-parameter模型计算不同种群间的遗传距离，利用DNAsp5.0软件检测全部样品的单倍型，并以深圳种群作为外类群构建基于单倍型的系统发育树。

使用贝叶斯推断和最大似然法两种方法构建系统发育树，核苷酸替代模型通过PhyML3.0软件中的SmartModelSelection在AIC准则下选出。

对于BI树，利用MrBayesv3.2.6软件，运行马尔考夫链蒙特卡罗500万代，每5000代抽样1次，并将25%的样品视为burn-in，重复运行3次以确保结果的收敛性。

对于ML树，利用RAxMLHPC2v8.2.10软件构建，bootstrap值设为1000次，使用Network5.0.1.0软件以邻接法构建各单倍型之间网络关系图，并对图中各个单倍型进行种群对应关系分析。

基于13个微卫星位点的分型数据推断全部样品的种群遗传结构，为了确定最佳分簇，运行20万代作为burn-in并随后运行马尔考夫链蒙特卡罗200万代，K设置为1‒10并且每个K重复10次。

最佳分簇由ΔK确定，并在StructureHarvester中实现，使用Adegenet软件包对13个微卫星位点数据进行主成分分析，以进一步确定是否存在明显的种群结构。

为检测不同种群间是否存在明显的基因流，使用IMa3软件基于Cytb和两个核基因的数据估算基因流的大小和方向，运行马尔考夫链蒙特卡罗100万代并以其中10%作为burn-in。

3个位点的核酸替代模型为HKY，软件中不提供GTR模型，重复操作3次，并以有效取样大小(effectivesamplesize，ESS)大于200作为收敛性的标准。

遗传距离

基于K2P模型得到唐鱼养殖种群和野生种群间的遗传距离结果，范围从0.001‒0.015，新加坡养殖种群和加拿大养殖种群之间，以及新加坡养殖种群和清远种群之间遗传距离最小。

加拿大养殖种群和深圳种群，以及石门和深圳种群之间遗传距离均最大，野生种群间的遗传距离在0.005–0.015之间，而养殖种群间的遗传距离为0.001–0.009。

其中加拿大养殖种群和新加坡养殖种群，与清远种群之间遗传距离分别为0.001和0.002，暗示这两个养殖种群与清远种群之间的亲缘关系很近。

但同为养殖种群的芳村养殖种群却与加拿大和新加坡养殖种群遗传距离较大，分别为0.009和0.008，甚至达到了野生种群之间的遗传距离，表明芳村养殖种群可能混有不同野生种群的线粒体基因。

利用贝叶斯推断和最大似然法构建分子系统发育树得到的拓扑结构一致，因此将两种树合并为一种树。

从系统发育树中可以看出，29个单倍型可以分为5支，深圳种群的所有单倍型构成最外面的一支，其余4支均至少包含1个芳村(FC)养殖种群的单倍型。

需要特别注意的是，FC支仅由芳村养殖种群的单倍型组成，且位于系统树中内群的基部，清远种群的单倍型与3个养殖种群的单倍型聚在一起构成FCQYSIGCA支。

剩余2支分别由石门和芳村、良口和芳村的单倍型组成，另外2个野生种群石门和良口的单倍型各自形成单系并获得了非常高的支持率。

为了更好地阐明唐鱼29个单倍型之间的关系，将本研究获得Cytb基因的29个单倍型进行了单倍型网络亲缘关系分析，用各单倍型之间基于碱基个数差异的遗传距离绘制了单倍型网络图。

各单倍型之间的变异步数在1–10之间，表明唐鱼养殖种群和野生种群之间的遗传分化不明显。单倍型网络图分支结构与系统发育树基本一致。

芳村养殖种群拥有最多的单倍型，且其单倍型位于单倍型网络图的中心位置，清远种群只有1个单倍型且与芳村养殖种群共享。

新加坡养殖种群的单倍型突变自芳村养殖种群的单倍型，而加拿大养殖种群的单倍型则突变自新加坡养殖种群的单倍型。

良口、石门和深圳种群的单倍型均为特有单倍型并且位于单倍型网络图的外围。相较于深圳种群，良口和石门种群的单倍型数量更少。

由于基于线粒体基因所揭示的种群遗传结构具有较强的偏倚性，因此本研究利用13个微卫星位点的分型数据，进一步检测唐鱼养殖种群及广州邻近地区的野生种群，是否存在明显的种群遗传结构。

唐鱼养殖种群和野生种群间存在明显的遗传结构，K=2为最佳分簇，芳村、加拿大、新加坡、清远分为一簇，良口、石门分为另一簇。

另外3个养殖种群的部分个体与良口和石门种群共享部分等位基因，表明养殖种群可能引入了这2个野生种群的个体。

虽然与养殖种群归为同一簇，但清远种群色块组成较为单一，表明只有很少的其他种群的基因混入其中。

良口和石门种群形成同一单色块，暗示其具有相同遗传组成且没有混杂入其他种群的基因。主成分分析结果进一步揭示了唐鱼养殖种群和野生种群的遗传组成差别。

虽然野生种群和养殖种群能够较好地分开，但也存在部分相似，3个养殖种群在两个主成分上高度重叠，表明其遗传组成有很大部分相同，不易区分。

同时芳村养殖种群拥有最大范围的主成分变异，表明其基因型更为丰富。相对于良口和石门种群，清远种群明显与3个养殖种群距离更近并存在部分重叠。

与STRUCTURE结果不同，良口和石门种群可以清楚地分开，最终表明两个种群在等位基因组成上存在明显差异。