甲基化包括DNA甲基化、RNA甲基化和蛋白质甲基化，分别对核酸和蛋白质进行修饰，与恶性肿瘤、衰老、老年痴呆等众多疾病相关。DNA甲基化（DNA methylation）是最早被发现，也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。

一、概念和原理

广义上的DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S—腺苷甲硫氨酸（S—adenosyl methionine，SAM）作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。

虽然甲基化修饰有多种方式——被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位和胞嘧啶的C-5位（分别由不同的DNA甲基化酶催化），但大多发生在基因启动子区CpG岛上。一般研究中涉及的DNA甲基化主要指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程①，其产物称为5—甲基胞嘧啶（5—mC）。这种5'方向的DNA甲基化方式可见于所有脊椎动物，表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA甲基化方式的选择以及DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组中有重要作用，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。

① DNA甲基化时，胞嘧啶从DNA双螺旋上突出，进入能与酶结合的裂隙中，在胞嘧啶甲基转移酶的催化下，将活性甲基从S一腺苷甲硫氨酸转移至胞嘧啶5位上，形成5一甲基胞嘧啶（5一MC）。

DNA甲基化分为两类，一种是从头甲基化，另一种是保留甲基化。从头甲基化是指不依赖现有的甲基化DNA链、在新位点进行甲基化反应。保留甲基化是指双链DNA中有一条已经存在甲基化，另一条未甲基化链被甲基化。

基因组中DNA的甲基化是通过DNA甲基转移酶实现的。DNA甲基化酶分为两类，即维持DNA甲基化转移酶（维持甲基化酶，Dnmtl）和从头甲基化酶。根据序列的同源性和功能，真核生物DNA甲基化转移酶又分为4类：Dnmtl/METl、Dnmt2、CMTs和Dnmt3。Dnmtl/METl类酶特异性地参与CG序列甲基化的维持，主要特征是其催化区T和Ⅳ包埋染色体的主区。CMTs类酶仅在植物中发现。Dnmt3又分为Dnmt3a和Dnmt3b，在小鼠、人类和斑马鱼中得到鉴定，其在未分化的胚胎干细胞中高度表达，但在体细胞中表达水平很低；它们的主要作用是从头甲基化，但对维持甲基化也起到一定的作用，并且负责重复序列的甲基化。

由于Dnmtl和Dnmt3基因家族没有针对CpG二核苷酸序列的特异性，人们因此提出了DNA甲基化转移酶发现靶位点的机制。首先，甲基化转移酶并不是同等地接近所有染色体区域。具有染色体重构和DNA螺旋酶活性的蛋白质能调节哺乳动物细胞内DNA甲基化，如SNF2家族2个成员ATRX和Lsh。其次，附件因子（蛋白质、RNA等）能召集DNA甲基化转移酶到特定基因组序列或染色体结构中，如pRB蛋白等能够与Dnmtl作用，在S期晚期将它召集到高度甲基化的异染色质区。

二、影响

DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。研究表明，DNA甲基化可引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式等的改变，从而影响基因的表达。

DNA甲基化是真核细胞正常而普遍的修饰方式，也是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传学形式。DNA甲基化后的核苷酸顺序和组成未发生变化，但其基因表达受到影响。基因启动子区的甲基化会影响其与RNA聚合酶结合，导致转录沉默（转录沉寂）。

哺乳类动物一生中，DNA甲基化水平有着两次显著变化：第一次发生在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除DNA分子上几乎所有从亲代遗传下来的甲基化标记；第二次发生在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，构建性甲基化酶使DNA重新建立一个新的甲基化模式。一旦细胞内新的甲基化模式形成，将通过维持甲基化酶以“甲基化维持”的形式将新的DNA甲基化模式传递给所有子细胞DNA分子上。这就解释了基因印记不是一种突变，不是一种永久、而是可逆的变化——它只持续于个体的一生中，在下一代个体的配子形成时，旧的基因印记消除并发生新的基因印记。由此可见，遗传印记的分子机制之一可能就是DNA甲基化。在遗传印记与肿瘤的研究中也发现肿瘤抑制基因P16，甲基化使之失活，去甲基化可使之恢复该基因本来的特性。而异常甲基化可能是肿瘤发生的重要原因之一。这说明DNA甲基化的修饰有着广泛的作用。

将携带甲基化和非甲基化肌动蛋白基因的重组质粒分别导入培养的肌细胞后，二者转录水平相同，因为肌细胞中存在去甲基化的酶将甲基基团去除。

细胞在发育过程当中，各种表观遗传学现象都是密切联系的。DNA甲基化作为一种较为稳定的修饰状态，可随着DNA复制遗传给下一代。在个体发育中，甲基化区域是动态变化的。

细胞发育过程中，各种表观遗传学现象之间不是孤立存在而是密切联系的。DNA甲基化同组蛋白甲基化共同调控基因表达的现象最早在链孢霉（Neurospora crassa）中得到证实，进一步的研究表明，DNA甲基化是受组蛋白甲基化调节的，如组蛋白修饰H3K9me②能够促进DNA甲基化的进程。对哺乳动物的研究发现，DNA甲基化是建立和维持其他表观遗传学现象的基础，比如DNA甲基化位点可以募集诸如组蛋白去乙酰化酶等具有抑制功能的复合物，同时除掉该位点附近的组蛋白乙酰化标记。

DNA甲基化修饰有三种类型，5mC是其中最重要的一种修饰，广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中, 称誉为“第五碱基”；5hmC是新发现的一种的修饰碱基，称为哺乳动物的“第六碱基”；6mA在细菌、藻类及动植物基因组中存在。

脊椎动物基因有三种甲基化状态：①持续低甲基化状态，如管家基因；②去甲基化状态，如发育阶段中的一些基因；③高度甲基化状态，如女性的一条失活的X染色体。

②H3K9me：H3K9是指组蛋白H3上的第9个赖氨酸，该赖氨酸可以被甲基化，加一个甲基就是me1（mono-methylation），两个甲基me2（di-methylation），最多可加三个甲基即me3（tri-methylation）。

三、常用的相关技术

甲基化特异性酶切：通过使用一些特定的酶切剂，可以将甲基化的DNA分子切割成较小的片段，从而便于后续的实验处理。

甲基化敏感PCR：在PCR反应中添加一些甲基化敏感的限制酶，可以选择性地扩增未甲基化的DNA序列，从而减少甲基化对PCR扩增的干扰。

甲基化特异性PCR：通过使用一些特定的引物和PCR条件，可以选择性地扩增甲基化的DNA序列，从而方便对甲基化位点的检测和分析。

甲基化特异性测序：通过使用一些特定的测序方法，可以对DNA分子上的甲基化位点进行高分辨率的检测和定量分析。

甲基化特异性修饰：通过使用一些特定的化学试剂或酶，可以选择性地去除或添加DNA分子上的甲基基团，从而影响DNA的表达和功能。

四、DNA去甲基化

甲基化的DNA可以发生去甲基化。DNA的去甲基化由基因内部的片段及与其结合的因子所调控。有两种假说可以解释DNA去甲基化的分子机制：一种假说认为此过程与DNA半保留复制联系在一起，为被动去甲基化。如果甲基化的DNA经半保留复制后不被甲基化，其DNA则处于半甲基化状态，半甲基化的DNA如再次发生DNA半保留复制，而DNA甲基化活性仍被抑制，则有50%细胞处于半甲基化状态。第二种假说认为此过程与半保留复制无关，为主动过程。DNA去甲基化是在DNA去甲基化酶催化下脱掉甲基化碱基的反应，等同于被损伤的DNA在糖苷酶及无碱基核酸酶酶切偶联催化下的修复反应。5一甲基胞嘧啶糖基化酶是体内候选去甲基化酶。此外，甲基化CpG结合蛋白如MBD2等也具有去甲基化酶的活性。

DNA甲基化和去甲基化是重要的表观遗传调控之一，其在基因转录、生长发育和疾病过程中都有着重要的作用。

几年前的一个研究揭示了DNA去甲基化对DNA损伤与修复③ 的调控作用。ATM和ATR蛋白激酶是DNA损伤应答反应中重要的核心调控因子。研究人员发现ATR依赖的DNA损伤应答反应能直接引起TET3酶介导的DNA去甲基化中间产物5hmC的增加；在分子机理层面上，研究人员证实了在ATR依赖的DNA损伤应答反应过程中，ATR通过磷酸化TET3增加其稳定性和5hmC生成活性，从而促进DNA损伤的修复；TET3功能缺失延缓DNA损伤的修复，导致细胞凋亡水平加重。该研究首次揭示了TET3介导的去甲基化在ATR依赖的DNA损伤修复中的重要作用，为进一步认识和理解机体在维持基因组完整性和DNA损伤修复的调控机制提供了基础。

③ 准确而有效的DNA损伤与修复应答对机体各种类型的细胞维持基因组完整性是十分重要的，DNA损伤修复功能障碍可能会引起严重疾病，包括多种癌症、免疫缺陷、代谢紊乱、血液系统疾病、衰老以及神经系统疾病等。

　目前主要有两种去甲基化方式，分别为主动途径和被动途径：

1、主动途径：是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录，但是，甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子（SP1、CTF、YY1）,使它们失活，从而阻断转录。

　　2、被动途径：核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNM T1 的作用。

五、DNA甲基化检测方法

(1) 甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

(2)亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计BSP引物进行定量PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶（最好达到100%转化和最大限度地回收DNA（DNA会片段化和降解））。最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

(3) 高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

(4) 基因组直接测序法

基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA甲基化的研究方法，用Maxam—Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理，并以连接介导的PCR来放大信号强度，然后进行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam—Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解，故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用MnO4- 哌啶法，结果则反之因此在检测5mC时，此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM-PCR结合后，大大降低了对基因组DNA的需要量（1～2 ng）。当5mC和C同时处于不同DNA分子上的同一位点时，该位点至少要有25%的5mC才能被N2H4法检测到；MnO4-法比N2 H4法更灵敏。这两种基因组DNA化学修饰法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性，无须进行DNA哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。

附：DNA甲基化与基因沉默关系的揭示

2021年的一篇题为“MBD5 and MBD6 couple DNA methylation to gene silencing through the J-domain protein SILENZIO” 的研究论文描述了两种拟南芥甲基-CpG 结合域蛋白 MBD5 和 MBD6，它们通过识别 CG 甲基化被招募到染色质，并在不影响 DNA 甲基化水平的情况下抑制基因和转座子的子集。

　　这些甲基阅读器招募了一种 J 结构域蛋白 SILENZIO，它在功能丧失和功能获得实验中充当转录抑制因子。J 域蛋白通常作为 HSP70 的共同伴侣。事实上，该研究发现 SILENZIO 的保守 J 域基序是其与 HSP70 相互作用及其沉默功能所必需的。这些结果揭示了分子伴侣 J 结构域蛋白在 DNA 甲基化下游的基因沉默中的前所未有的作用。

　　另外，2018年12月7日，美国科学院院士Steven E. Jacobsen及Falk Butter合作在Science发表题为“A DNA methylation reader complex that enhances gene transcription”的研究论文，该论文鉴定了拟南芥中的蛋白质复合物，其通过DNA甲基化被募集到染色质中。该复合物特异性地激活已经轻度转录但对转录沉默基因（例如转座因子）没有影响的基因的转录。因此，该复合物抵消了由邻近基因中的转座子插入引起的抑制效应，同时使转座子保持沉默。因此，通过平衡抑制和激活转录效应，DNA甲基化可以起到微调基因表达的作用。

　　真核生物中的胞嘧啶 DNA 甲基化 (mC) 通常与基因和转座因子 (TE) 的转录沉默有关，但对其机制知之甚少 。哺乳动物基因组编码几种甲基-CpG 结合域 (MBD) 蛋白，这些蛋白部分通过识别甲基化 CG 二核苷酸而被募集到染色质，但它们也在基因调控中发挥与甲基化无关的作用。一种流行的模型是 MBD 将组蛋白去乙酰酶复合物募集到甲基化 DNA，导致染色质凝集和基因沉默。在植物中，DNA 甲基化的丧失会导致许多转座子和基因的去阻遏 ，但没有发现甲基阅读器在此过程中的作用的证据，因此甲基标记下游的作用尚未解决。

　　从拟南芥中甲基读取器的质谱筛选中鉴定了两种名为 MBD5 和 MBD6 的蛋白质。MBD5 和 MBD6 属于一个由 13 个成员组成的家族，这些成员已通过与人类 MBD 域的序列相似性进行鉴定。在该域之外，植物和动物之间没有序列保守性。 MBD5 和 MBD6 是近亲，它们可以在体内相互作用，并且在电泳迁移率变化测定中显示可以结合甲基化探针。

　　虽然尚未将功能分配给 MBD5，但已显示 MBD6 是异源四倍体遗传杂种中核糖体 RNA 基因调控所必需的。在植物中，5-甲基胞嘧啶在 CG、CHG 和 CHH 序列环境中很常见。MBD 通常识别对称甲基化的 CG 二核苷酸，但也有报道称例外，例如 MeCP2，它也可以结合 mCA 位点。

　　该研究描述了两种拟南芥甲基-CpG 结合域蛋白 MBD5 和 MBD6，它们通过识别 CG 甲基化被招募到染色质，并在不影响 DNA 甲基化水平的情况下冗余抑制基因和转座子的子集。

　　总之，这项工作确定了一种将 DNA 甲基化与 CG 甲基化标记的位点沉默联系起来的途径。甲基结合蛋白 MBD5 和 MBD6 的特征表明它们可能通过与动物中已知 MBD 蛋白不同的机制起作用。 J 结构域蛋白 SILENZIO 作为沉默效应子的鉴定进一步表明甲基化下游的基因抑制与分子伴侣活性有关，并且这种新途径可能在不同的植物谱系中保守。