文｜鹤白贤人

编辑｜鹤白贤人

«——【·前言·】——»

通过16S rDNA测序鉴定发现，在76个分离株中，53%属于保加利亚嗜酸乳杆菌亚种，14%属于其他乳杆菌，32%属于乳酸球菌。

所有分离株抑制了病原细菌的生长，18个分离株能够产生胞外外多糖（EPS），而其中24%表现出极高的蛋白质降解活性。

值得注意的是，10个保加利亚嗜酸乳杆菌菌株能够产生益生元低聚半乳糖，高分辨率精确质谱分析揭示了含有非典型β糖苷键的三糖和四糖的产生。

这是首次报道保加利亚嗜酸乳杆菌具有这种特性。

基于这些有益特征以及良好的技术行为，研究人员推荐几个分离株作为非常有前景的保加利亚酸奶发酵剂。

«——【·保加利亚酸奶的益处·】——»

一直吸引着人们极大的兴趣，因为它被证明对消费者有益，保加利亚土地上制作酸奶的第一个历史证据来自公元前4000年，那时特拉西亚人驯化了羊。

在5至7世纪，酸奶成为了斯拉夫人和古代保加利亚人的常用食品，就像面包一样。

保加利亚酸奶的益生菌作用的第一个证据可以追溯到16世纪，当时法国国王弗朗索瓦一世通过简单的酸奶饮食治愈了慢性腹泻，保加利亚酸奶的益处在上世纪得到了广泛的研究。

著名的俄罗斯生物学家Elie Metchnikoff，发展了他的关于延年益寿的理论，他是第一个提出每天食用酸奶可以延长保加利亚人的寿命的人。

保加利亚微生物学家Stamen Grigoroff首次展示了导致酸奶发酵的细菌，他发现了一种称为保加利亚乳杆菌-Grigoroff的杆状细菌。

根据联合国粮农组织和世界卫生组织的定义，酸奶是指由含有保加利亚乳杆菌和热带链球菌的共生发酵菌启动子发酵的牛奶。

最终产品每克酸奶含不少于10^7个活菌落形成单位，酸奶的主要有益效果是由发酵菌启动子产生的有机酸和抗微生物物质引起的。

这些菌株对胃肠道中的病原体具有抗微生物效果，缓解乳糖不耐受和腹泻，刺激免疫系统，预防结肠癌，并产生可以控制血压的生物活性肽。

许多研究表明，保加利亚乳杆菌菌株对艰难梭菌、肠杆菌科、变异链球菌和绿脓杆菌等病原体具有活性。

保加利亚乳杆菌的七个分离物类似于乳酸菌素的物质，甚至对抗抗生素耐药的幽门螺杆菌菌株也具有活性。

根据保加利亚乳杆菌产生的乳酸异构体，发现了其相对于传统益生菌的新优势。Toyoda等人指出，D-乳酸可以增强帕金森病患者的培养神经元存活。

由于Lb. bulgaricus能够产生D-乳酸，因此强烈推荐大量食用酸奶来治疗和预防帕金森病。

在Lb. bulgaricus被发现的110年后，全球范围内的酸奶消费量不断增加。

保加利亚的几个地区被认为含有特有的酸奶微生物群落：特兰地区、西巴尔干山脉、中巴尔干山脉、东巴尔干山脉、色雷斯谷和玫瑰谷、里拉山、皮林山和罗多佩山。

基于这些地区独特的酸奶微生物多样性，研究人员探索了许多新的有前景的分离株。

在这里，研究人员报道了结合了优异技术行为和有益特性的菌株的表征结果。

«——【·材料和方法·】——»

在保加利亚，研究人员收集了77份不同种类的牛奶酸奶样品，包括古老的民族食谱制作的牛奶酸奶、羊奶酸奶、山羊奶酸奶和水牛奶酸奶。

研究人员通过访问一些偏远的村庄、博物馆村庄、修道院和高山乳制品农场来获取这些样品。这些样品的采集时间跨足了2015年到2016年的两年时间。

在抗菌活性实验中使用的测试微生物包括大肠杆菌ATCC®25922™、肺炎克雷伯氏菌G31 NBIMCC 8650、非O1型霍乱弧菌NBIMCC 8716和李斯特菌ATCC®19115™。

研究人员在MRS培养基中培养了乳酸杆菌；在M17培养基中，以42°C或37°C在厌氧条件下使用Anaerocult® A mini培养了乳酸球菌。

大肠杆菌ATCC®25922™和肺炎克雷伦菌则在LB培养基中生长，非O1型霍乱弧菌在营养琼脂培养基中生长，而单核细胞增多李斯特菌ATCC®19115™在BHI培养基中生长。

这些菌株在37°C的水浴旋转振荡器GFL 1092 上以100rpm的搅拌速度培养。所有培养基均由德国卡尔罗特有限公司供应，如有需要，培养液中添加1.5%的琼脂进行固化。

为了分析代谢物的轮廓，研究人员采用了两种不同的方法：

(i) 在含有4.1% (w/v) 乳糖的脱脂牛奶中培养，以最佳温度在24-48小时内，然后通过离心将酸奶分离，并分析可溶性代谢物。

(ii) 在含有10 g/L细菌蛋白胨、5 g/L酵母提取物、8 g/L肉提取物、5 g/L乙酸钠、2 g/L K2HPO4、2 g/L重碳酸铵、0.1 g/L硫酸镁、0.1 g/L硫酸锰和40 g/L乳糖的乳糖培养基中培养。

利用Perkin Elmer HPLC系统Series 10 配备的折射率RI检测器，研究人员检测了微生物代谢产物的液体产物以及剩余的糖分。

并且使用了一根Aminex HPX-87H HPLC柱，在65°C下，以流速0.6 mL/min和移动相为5 mmol/L硫酸（H2SO4），来测定乳酸、琥珀酸和乙醇含量。

葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖则通过一个BioRad HPX-87C柱在85°C下隔离分离。

至于GOS的定量分析，我们使用了菜豆三糖作为标准物质，所有的标准物质均购自德国达姆施塔特的默克股份有限公司。

研究人员在配有TurboFlow® LC系统和IonMax II®电喷雾离子化模块的Q Exactive®质谱分析仪上进行了分析，使用Atlantis T3, 3.5 微米色谱柱，采用以下流动相：

A - 20 毫摩尔/升乙酸铵水溶液；B - 缓冲液A/乙腈，流速为300 微升/分钟，渐变条件为：0% B 持续180 秒；0%–60% B 持续150 秒；60% B 持续30 秒；60%–0% B 持续60 秒。

当0% B 持续5 分钟，进样体积为10.0 微升。

该分析使用了一台装备有加热电喷雾电离模块IonMax®的Q Exactive混合四极-轨道飞行时间质谱仪。

在负离子模式下，对100-2000个质荷比范围内的全扫描光谱进行了采集，分辨率设定为140,000。

所有质谱参数均使用仪器控制软件程序进行了敏感性优化以适应目标分析物。

Q Exactive的参数包括喷雾电压4.0 kV，护套气体流速32，辅助气体流速10 L/min，备用气体流速3 L/min，毛细管温度280 °C，探针加热器温度300 °C和S镜射频水平50。

多糖的定性分析采用了并行反应监测PRM模式。优化的碰撞能量值为HCD 30%。

选择了m/z 341.11作为二糖的离子，m/z 503.16作为三糖的离子和m/z 665.21作为四糖的离子，用于并行反应监测。

数据采集和处理通过Xcalibur 2.4®软件包进行，理论m/z值的计算使用Mass Frontier 5.1软件程序完成。

研究人员使用Protease Colorimetric Detection Kit PC0100来测定细胞外蛋白酶的活性，该实验使用了25 微升无细胞上清液和1% Hammarsten酪蛋白作为底物。

在37°C、pH 7.5的实验条件下，一个单位的蛋白酶活性在1分钟内释放1 微摩尔酪氨酸。所呈现的数据已经换算成了Anson单位。

«——【·探讨·】——»

保加利亚酸奶是最受欢迎的酸奶之一。由于其在全球范围内广为人知的健康效益，它已经成为保加利亚的标志。

一些保加利亚机构致力于研究乳酸菌的生物多样性，分离纯培养物，并维护乳酸菌菌株的集合：

国家工业微生物和细胞培养库，私营乳制品公司Lactina和Genesis，保加利亚科学院微生物研究所，以及政府拥有的公司LB Bulgaricum Plc.。

该公司拥有最丰富的共生Lb. bulgaricus/Str. thermophilus起始菌种选择。

然而，这些集合中的许多菌株不仅来自酸奶，还来自其他各种乳制品：白色和黄色硬奶酪，katak ，植物叶子，发酵食品和饮料。

一部分酸奶菌株，最初根据形态和生化标准被归类为Lb. bulgaricus，通过DNA指纹技术重新分类为Lb. lactis或Lb. Helveticus。

丰富而有代表性的保加利亚酸奶样本集，覆盖了整个国家的领土，并确保样本的独特性。

从保加利亚60个不同地点收集的77个家庭制作的酸奶样本中获得了76个不同的乳酸菌菌株。

使用选择性培养基分离了这些菌株，其选择的表型标准是革兰氏阳性染色，菌落的阴性过氧化氢酶反应以及产生乳酸的能力。

基于16S核糖体RNA基因测序的遗传鉴定确定了六种不同的乳酸杆菌物种。

除了保加利亚酸奶中含有的Lb. delbrueckii亚种bulgaricus之外，还包括Lb. delbrueckii亚种lactis、Lb. helveticus、Lb. paracasei、Lb. rhamnosus和Lb. fermentum。

其中一种呈杆状的乳酸菌被鉴定为Weissella confusa。

在乳酸球菌中，有13株为Pediococcus acidilactici，5株为Streptococcus thermophilus，4株为Enterococcus faecium，2株属于Leuconostoc属。

考虑到按地区分布，拥有最丰富乳酸菌多样性的酸奶来自罗多普山脉，在那里的大多数样本中含有两种或三种不同形态的乳酸菌菌株。

然而，在中部和西巴尔干地区，Lb. bulgaricus和Str. thermophilus菌株之间的原始协作得到了最好的保留。

罗多普山脉的酸奶是富含具有益生菌特性的Lb. bulgaricus菌株的重要来源，与P. acidilactici菌株共存。

正如预期的那样，大部分传统酸奶中含有Lb. bulgaricus菌株，在保加利亚酸奶样本中发现的其他乳酸菌物种包括Lb. lactis和Lb. helveticus，正如Dimitrov等人所观察到的。

Lb. fermentum在保加利亚酸奶中是完全非典型的。

这是首次报道Lb. paracasei和Lb. rhamnosus这两个物种作为酸奶的伴生微生物。

值得注意的是，在保加利亚酸奶中与Lb. bulgaricus的经典共生伴侣，Str. thermophilus，仅在77个样本中的5个中存在。

使用脱脂牛奶或乳糖培养基评估菌株产生液态代谢物的能力，所有的Lb. bulgaricus和两株Str. thermophilus菌株都能使牛奶凝结，并被视为主要的发酵剂。

伴随的菌株则不具备这种能力，所有的Lb. bulgaricus菌株都能迅速使牛奶凝固，并分解大量的乳糖。

在24小时内能在牛奶中产生10克/升以上乳酸的孤立菌株有Lb. bulgaricus菌株1、2、20、32、37、44、56、57、59和62。

Lb. bulgaricus菌株9、41、43、46和74是中度酸化菌株，即使在48小时的发酵期间也不会合成过多的乳酸。

最高产乳酸量的是Lb. helveticus 16，除了乳酸外，Lb. bulgaricus菌株37还产生0.1克/升琥珀酸。

Lb. bulgaricus菌株在发酵牛奶过程中累积了半乳糖，含量从4.7克/升到13.5克/升，但由于乳糖转运的机制，它们无法将其转化。半乳糖是乳糖的两倍甜，并且可能增强酸奶的甜味。

部分伴随的乳酸杆菌是异型发酵菌，Lb. fermentum菌株产生的乙醇量为5-6.75克/升。

乳酸菌LABs利用牛奶蛋白质作为必需氨基酸的主要来源，蛋白酶酶能水解α-酪蛋白和β-酪蛋白中超过40%的肽键，导致在牛奶发酵过程中形成100多种不同的寡肽。

其中一部分肽能促进矿物质的吸收，由Lb. bulgaricus菌株产生的其他肽据已知具有抑制血管紧张素转化酶ACE的活性，参与血压调节，或参与抗菌活性。

大部分新分离的乳酸菌菌株具有较高的蛋白酶活性，以酪蛋白为底物，其活性值超过250 AU/mL。

Lb. bulgaricus菌株63、71和69显示出最高的活性，分别达到308.4、318和329.4 AU/mL。

Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus对脯氨酸含有的底物具有高度特异性。

乳酸球菌甚至比乳酸菌更具蛋白水解能力，显示出极高值的菌株有Leuconostoc mc 24和mc 33，以及Ent. faecium c 5，在链球菌中，Str. thermophilus c 37以334.5 AU/mL脱颖而出。

由于只对细胞外蛋白酶活性进行了测定，Str. thermophilus菌株显示出的高蛋白水解活性可能是由于细胞外膜蛋白酶的存在，这些酶通常会释放到培养基中。

Str. thermophilus c 37和c 31的高蛋白酶活性使这些菌株能够在牛奶中更快地生长并产生乳酸。

大多数新分离物能够抑制病原细菌的生长，由乳酸产生的低pH是对革兰氏阴性病原体，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和霍乱的病原弧菌。

最强大的抗菌因子，Lb. bulgaricus菌株44、46和63的无细胞上清液，即使中和至pH 6.0并经过过氧化氢酶处理，仍保持其杀菌效果，这暗示了细菌素的存在。

同样适用于P. acidilactici菌株c 27和c 59，以及Str. thermophilus菌株c 21，有趣的是，对李斯特菌ATCC®19115™显示出活性的两个菌株是P. acidilactici物种的c 15和c 53。

由于这种活性与P. acidilactici在与Lb. bulgaricus共培养时在牛奶中产生的帕地孔菌素的产生一致，这些菌株可能会进一步进行细菌素的生产研究。

«——【·笔者结语·】——»

保加利亚的特殊自然和气候条件，促使酸奶起始培养物具备独特特性的自然演化，能够产生益生元的Lb. bulgaricus主要来自罗多普山村、绵羊和水牛酸奶。

具有抗微生物活性的乳酸菌菌株在整个国家范围内分布均匀，主要分布在海拔高于1500米的山区。

对保加利亚酸奶微生物多样性的全面检查表明，位于保加利亚山区的小农场生产的自制酸奶是富含乳酸菌的宝贵资源，具有促进健康的效果。

这些新分离物具备优益品质和良好的技术特性，使它们在酸奶制造中有着非常有前途的应用前景。

«——【·参考文献·】——»

1. Ivanova, I., Kabadjova, P., Pantev, A., & Danova, S. (2010). Microbiological, physicochemical and sensory characteristics of the traditional Bulgarian yogurt. International Journal of Dairy Technology, 63(3), 358-366.

2. Dimitrov, Zh., Nacheva, I., Ivanova, I., & Gotcheva, V. (2019). Microbial diversity of Bulgarian yogurt starter cultures revealed by 16S rRNA gene sequencing. Food Microbiology, 83, 31-40.

3. Marinova, M., Ivanova, I., & Danova, S. (2015). Health-promoting potential of lactic acid bacteria isolated from Bulgarian traditional dairy products. Food Science and Technology International, 21(1), 31-40.

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