Molecular and Pharmacological Bladder Cancer Therapy Screening: Discovery of Clofarabine as a Highly Active Compound

Iris E. Ertl,

Ursula Lemberger,

Dafina Ilijazi,

...

Stefan Kubicek,

Walter Berger,

Shahrokh F. Shariat

Published online: April 04, 2022

p261-270

背景膀胱癌（BCs）的异质性是开发新疗法的主要挑战。然而，鉴于复发率和/或治疗失败率高，确定有效的治疗策略是临床上的当务之急。目的我们旨在建立药物鉴定/再利用的模型系统，以确定治疗BC的新疗法。设计、设置和参与者对市售BC细胞系（n = 32）的集合进行了全面表征。选择代表广谱BC的23个细胞系的小组进行高通量药物筛选。结果测量和统计分析阳性命中被定义为在至少一个BC细胞系中给予>50%抑制的化合物。结果和限制在>1700种测试化合物中，共有471种物质表现出抗肿瘤作用。氯法拉滨是一种抗代谢药物，用作儿童急性淋巴细胞白血病的三线治疗，是对所有内在亚型细胞系具有抑制作用的有限数量的药物之一。因此，我们重新评估了该物质，并确认了其对市售细胞系和代表各种疾病阶段，内在亚型和组织学变异的患者来源的细胞培养物的抑制作用。为了验证体内的这些效果，使用了患者来源的尿路上皮癌（UC）细胞异种移植模型。耐受性良好的氯法拉滨剂量可诱导所有患有早期和晚期疾病的治疗动物（n = 12）的完全缓解。我们进一步利用了另一种源自罕见疾病实体结节样癌（SaC）的患者来源的细胞异种移植模型。与UC异种移植小鼠类似，氯法拉滨诱导亚完成所有治疗动物的肿瘤缓解（n = 8）。结论氯法拉滨在体外和体内的有效作用表明，我们的发现可能具有很高的临床相关性。需要临床试验来评估氯法拉滨在改善BC患者护理方面的价值。患者总结我们使用市售细胞系来鉴定用于治疗膀胱癌的新型药物。我们证实了其中一种药物氯法拉滨在患者来源的细胞系和两种不同的小鼠模型中的作用，从而证明了该物质在膀胱癌治疗中的潜在临床相关性。1. 引言膀胱癌（BC）是全球第十大最常见的癌症，估计每年有549.000例新病例和200.000例死亡].不列颠哥伦比亚省具有深远的个人和社会经济影响，是人均最昂贵的恶性肿瘤之一].对有效治疗的需求很高，未得到满足，以降低疾病复发/进展/死亡的风险，同时保持甚至改善与健康相关的生活质量（HRQoL）。对BC的分子基础的丰富理解有望揭示新的有效治疗策略。例如，最近的研究表明，BC可以分为各种内在亚型，对目前可用的疗法具有不同的敏感性.这些发现还揭示了BC的异质性和复杂性，导致频繁和早期的耐药性和高治疗失败率.在这项研究中，我们旨在建立一个系统，用于鉴定用于治疗各种BC亚型的新型和再利用的物质。为此，我们选择了一组市售细胞系（n = 23），代表广谱BC，我们对其进行了高通量药物筛选，从而鉴定出具有细胞毒性/细胞抑制作用的>470种物质。然后，我们选择了嘌呤类似物氯法拉滨进行更深入的研究，因为它对所有内在亚型的细胞系表现出抑制作用，并且由于其作为儿童急性淋巴细胞白血病孤儿药的临床可用性。此外，氯法拉滨与许多其他已鉴定的活性物质一样，属于抗代谢物类，最初是为血液系统癌症而开发的。除此之外，先前已经证明该药物被膀胱组织有效吸收.我们证实了氯法拉滨在市售细胞系和患者来源培养物（PDCs）中的浓度依赖性作用。此外，我们观察到，在小鼠异种移植模型中，它导致大量肿瘤缩小/完全缓解，这些模型是由代表尿路上皮癌和结节样癌变体的PDCs植入产生的。这些发现验证了我们的方法，并暗示了将这种抗白血病药物重新用于BC治疗的潜在临床价值。2. 材料和方法市售细胞系要么在ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）或DMSZ（德国布伦瑞克）购买，要么是康奈尔医学院（美国纽约州纽约）伊斯兰教法实验室的实物礼物。这些细胞系被认证（补充表1）。如前所述，从维也纳总医院通过外科手术获得的标本中建立患者来源的细胞系[[6]].通过免疫染色验证PDCs的上皮起源（补充图1）。通过在Illumina HiSeq2000测序仪上进行RNA测序（RNA-seq）建立市售细胞系的表达谱（Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。如前所述，蛋白质编码基因的突变通过RNA-seq鉴定[，并通过桑格测序验证。对于药物筛选，测试BC细胞系（n = 23）对包含在六种不同药物库中的1707种物质的敏感性。72小时后测定细胞活力;阳性命中被定义为给予>50%抑制的化合物。确定半最大抑制氯法拉滨浓度（IC50），用增加的浓度（1 nM-10μM）处理细胞系，并在48小时后测量细胞活力。通过在8-12周龄雄性CB17 / SCID小鼠的右侧皮下注射PDCs VUC38或VUC48建立尿路上皮癌（UC）和结节样癌（SaC）异种移植模型。氯法拉滨（50mg / kg）通过口服强饲法给药，每日一次，持续5-10 d。有关材料和方法的更详细说明，请参阅补充材料。3. 结果3.1 市售BC细胞系的亚型分类该研究使用了32种市售BC细胞系，这些细胞系来自不同阶段的非肌肉浸润性（NMIBC）或肌肉浸润性（MIBC）膀胱癌患者。这些细胞系包括表征良好（如5637和J82）和表征较差（如97-1和94-10）BC模型（表1) 该研究纳入了从不同阶段（Ta-T4）和等级（G1-G4）的NMIBC和MIBC建立的32个BC细胞系。除了起源于鳞状细胞癌（SCC）的SCaBER外，所有细胞系都来自尿路上皮癌（UC）。细胞系SV-HUC-1起源于由猿猴病毒SV40转化的正常输尿管组织。一个TSU-PR1细胞是T24的衍生物.

在新标签页中打开表格我们进行了RNA-seq（补充表2），并根据以前的出版物选择了表达标记，将这些细胞系分类为不同的内在亚型].通过聚类分析，我们确定了三种不同的表达类型，并将细胞系分配给腔（n = 6），基础（n = 18）或非特异性亚型（“非型”;n = 8;图 1A）.这是根据先前一项研究的结果，该研究将我们使用的20种细胞系分配给相同的内在亚型].对BC细胞系分类为腔内或基底的RNA-seq数据的基因集富集分析（GSEA）显示，与已知在腔内和基底乳腺癌亚型之间差异表达的基因集重叠（补充图2）) ].我们还使用基因集预测器BASE47和最近建立的单样本共识分类器分析了细胞系收集的RNA-seq数据（图1B和1C，补充图3和补充表3）) ].两种分类系统都证实了我们的方法（图1A-C）。

图 1一组市售膀胱癌细胞系的亚型分类。（A）包括35个表达标记的聚类分析确定了三种不同的内在亚型。一个簇由编码尿素蛋白UPK1A，UPK3A和UPK3B的基因的高表达水平以及代表腔内标记的低分子量角蛋白KRT20定义。第二组以KRT5和KRT6A，KRT6B和KRT6C的表达水平升高为特征，KRT6B和KRT6C是尿路上皮细胞的基础标志物。八种细胞系表现出两种表达标记物的低表达水平，因此被归类为“非类型”。（B）使用为区分高级MIBC的“腔”和“基底样”亚型而建立的BASE47基因集预测器对市售细胞系进行分类.聚类分析确定了两种主要的表达类型，其中一种由先前归类为腔的六种细胞系组成。（C） 应用单样本共识分类器，市售细胞系分为LumP，Ba / Sq或NE样。虽然以前被归类为腔体的所有细胞系都被归类为LumP，但除了一个基底细胞系外，所有细胞系都被分配到Ba / Sq亚型。以前未分配到特定亚型的细胞系被归类为NE样或Ba / Sq. Ba / Sq = 基底/鳞状;LumP = 腔状;MIBC = 肌肉浸润性膀胱癌;NE = 神经内分泌。

3.2 评估市售BC细胞系的基因组前景利用我们的RNA-seq数据，我们检测到癌症基因普查中包含的基因中的非沉默点突变，如前所述];Sanger测序验证了影响79个基因的192个改变，包括65个先前未报告的突变（补充表4) [

].此外，我们提取了公开可用的突变数据，从而全面了解了我们细胞系集合的基因组景观（补充表4）。评估最常受改变影响的位点（三个或更多细胞系），我们确定了48个基因（图2）。KEGG通路分析显示，参与59个信号通路的组分富集，其中许多先前已被证明与膀胱肿瘤发生和进展有关（补充表5和补充图4）。) [[25]].

图2在市售BC系中检测到的最常见突变的癌症图。评估最常受改变影响的位点（三个或更多细胞系），鉴定出48个基因，包括经典的BC相关基因（如TP53，PIK3CA，FGFR3和RB1），编码染色质结构表观遗传调节因子的基因（ARID1A / BAF250，KMD6A，EP300，CREBBP，KMT2C / MLL3和KMT2D / MLL4），原钙粘蛋白（FAT1和FAT4），细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKN1A和CDKN2A），小GTP酶的Ras亚家族成员（KRAS和NRAS）和跨膜粘蛋白（MUC4和MUC16）。与有关亚型富集的文献一致，FGFR3，PIK3CA和KMD6A的突变是代表腔内BC亚型的细胞系中最常见的改变之一。腔内簇也表现出PTPRT突变的富集。EP300和ARID1A的突变仅在属于基底或非特异性簇的细胞系中检测到。基底细胞系的常见改变包括TP53 / RB1和CDKN2A / FGFR3的共同发生突变。BC = 膀胱癌。3.3 BC细胞系代表性组合中的高通量药物筛选为了鉴定对BC具有抗肿瘤作用的新型药物，我们进行了高通量药物筛选。为了涵盖BC的宽谱，我们选择了所有分类系统一致分类为腔（例如，RT4和SW780）或基础（例如，KU1919和VMCUB1）的细胞系（图1A-C），以及通过单样本共识分类器（UMUC3和JMSU1;图 1我们还考虑了细胞系的突变景观;例如，我们选择了具有（RT4，RT112和SW780）的腔细胞系，并且没有激活FGFR3突变（JON;图 2）。此外，我们选择了先前被证明对顺铂具有高敏感性（如253J和647V）或耐药性（如HT1197和RT4）的细胞系，并排除了增殖速率特别低的细胞系（如DSH1）[[26]].我们评估了这些细胞系（n = 23）对包含在六个药物库（抗癌药物库;美国国立卫生研究院临床收集;天然，表观遗传和有毒化合物的文库;和云集合）;因此，我们鉴定了471种具有抑制作用的化学试剂（图3A和补充表6）。忽略泛毒性物质（在>95%的细胞系中的反应），批准的抗癌药物如罗吗啡肽，帕诺比诺他，帕那替尼，紫杉醇和去甲氧柔红霉素是最有效的药物之一（补充表6）。发现几种已批准的BC药物，例如多柔比星，长春花碱和甲氨蝶呤，所有这些都是MVAC的组成部分，是有效的（补充表6）。我们进一步确定了许多被批准用于癌症以外疾病的物质的抗肿瘤作用，包括降胆固醇药物，驱虫药，抗疟药和精神药物（补充表6）。除批准的药物外，筛选还鉴定了从草药和草药补充剂中提取的各种天然化合物（补充表6）。在先前的药物再利用筛选中也观察到许多这些物质（n = 101），包括各种非肿瘤药物（n = 27）对BC细胞系的抑制作用（补充表7) [

图3通过药物筛选鉴定出具有抗肿瘤作用的化合物。（A）共有471种化合物对至少一个BC系表现出抗肿瘤作用。暗场表示正命中。具有抑制作用的物质的比例（所有测试物质;n = 1707）为每个细胞系（底部）给出。总体而言，大多数腔细胞系的一般敏感性低于属于基底簇的细胞系。最不敏感的细胞系是RT4和HT1197。（B）具有已知作用机制的已鉴定物质的最大部分（n = 225）占激酶抑制剂（28%），HDAC抑制剂（11%）和抗代谢药物（8%）。此外，插层药物和/或拓扑异构酶抑制剂（6%），有丝分裂抑制剂（5%），离子通道调节剂（4%）以及靶向神经递质受体（4%）或激素受体（4%）的物质代表强烈。BET = 溴多马因和外部终端;HDAC = 组蛋白去乙酰化酶;HMT = 组蛋白甲基转移酶;KDM = 组蛋白赖氨酸去甲基化酶。

评估这471种物质的分子靶点，我们可以将其中48%分为不同的药物类别，而其余52%的作用机制尚不清楚或研究不充分（补充表6）。分类活性药物的最大比例包括激酶抑制剂（28%），包括受体酪氨酸和非受体酪氨酸激酶的选择性和非选择性抑制剂（图3B）。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC）、组蛋白甲基转移酶和组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂等表观遗传化合物分别占已鉴定活性药物的11%、4%和3%（n = 225）（图3B）。其他具有强烈代表性的药物类别是抗代谢物（8%），插入药物和/或拓扑异构酶抑制剂（6%），有丝分裂抑制剂（5%），以及离子通道，神经递质受体和激素受体的调节剂（4%;图 3B).与文献一致，我们发现被归类为腔内的细胞系，其中大部分来自低级别肿瘤（如RT4和SW780），其一般敏感性低于属于基底簇的细胞系（图3A）].然而，最不敏感的细胞系（对所有测试物质的<5%的反应）是RT4和HT1197，其中后者被归类为基础亚型（图3A）。这些细胞系先前被证明对顺铂具有高度耐药性[].HT1197和RT4几乎完全对表观遗传药物，插入剂/拓扑异构酶抑制剂和离子通道抑制剂有反应，其中后者已知参与多药耐药性的发展（补充图5）)3.4 通过药物筛选鉴定的一种高活性化合物的体外验证大多数对一种以上腔细胞系（n = 4）表现出抑制作用的抗癌药物占HDAC抑制剂和插层药物（补充表6）。许多这些物质已经在临床上使用（如表柔比星和阿霉素），或者它们对BC的抗肿瘤作用以前曾被报道过（如belinostat和panobinostat;补充表6) ].氯法拉滨迄今尚未在BC的背景下得到广泛研究，是对所有内在亚型具有抑制作用的药物之一（补充表6）。以各种浓度重新测试药物，我们发现IC的腔内和基底细胞系的活力降低50值范围为 0.53 至 4.4 μM（图 4A）。然而，HT1197和HT1367在最高测试浓度下分别显示仅降低21%和19%的活力（图4A）。先前已经证明ABC转运蛋白ABCG2可以诱导对氯法拉滨的耐药性,一致地，我们发现HT1197和HT1367在我们的市售细胞系集合中具有最高的ABCG2表达（补充图6A）。

图 4市售和患者来源的BC细胞系对不同浓度氯法拉滨的反应。（A）用不同浓度的氯法拉滨处理代表不同内在BC亚型的市售细胞系48小时。除HT1367和HT1197外，所有测试的BC系均显示细胞活力的浓度依赖性下降，IC50值范围为 0.53 至 4.4 μM。（B）用不同阶段肿瘤和组织学变异的患者来源细胞系用可变浓度氯法拉滨处理48小时，HT1367和HT1197的活力降低了<50%。与市售细胞系类似，氯法拉滨在所有患者来源的培养物中引起浓度依赖性活力下降。BC = 膀胱癌;集成电路50= 半最大抑制浓度;n.d. = 未定义。我们进一步测试了氯法拉滨在低传代次数下对PDCs的影响，代表了各种肿瘤分期/组织学变异，所有这些都显示出细胞活力的浓度依赖性降低（表2和图4B）。评估ABCG2表达，我们发现对氯法拉滨最不敏感的VUC71和VUC85与其他PDCs相比水平显着升高（补充图6B）。(HG = 高等级;PDC = 患者来源的培养物;RC =根治性膀胱切除术;SaC = 结节样癌;TURB =膀胱肿瘤的经尿道切除术;UC = 尿路上皮癌。)

从根治性膀胱切除术或膀胱肿瘤经尿道切除术期间获得的肿瘤样本中建立患者来源的细胞系。该研究纳入了7名患有不同肿瘤分期膀胱肿瘤（pT1a-pT3b）的男性和1名女性患者。虽然大多数PDC来自纯尿路上皮癌，但VUC38起源于纯肉瘤样癌。VUC14和VUC99来源于尿路上皮癌，分别具有结节样和鳞状分化。为了测试与其他药物的潜在相互作用，我们在HT1197中使用顺铂和/或HDAC抑制剂罗美臼蛋白酶进行了单次和双次治疗。氯法拉滨浓度为≥1μM引起细胞活力降低，通过将其与顺铂，罗美地红素或两种药物联合使用，这种效果显着增加（补充图7A）。更详细地研究氯法拉滨与顺铂或罗米色辛之间的相互作用，我们发现与两种药物的协同作用（补充图7B）。3.5 氯法拉滨抗肿瘤作用的体内验证为了验证氯法拉滨在体内的作用，我们使用患者来源的VUC48细胞（起源于常规UC）生成皮下小鼠异种移植模型，并在所有动物（n = 16）携带可触及肿瘤时开始治疗（表2）。在接受七剂氯法拉滨而没有明显的副作用后，所有治疗的小鼠（n = 8）都经历了完全缓解（图5A，左）。为了评估氯法拉滨对更晚期疾病阶段的影响，我们允许VUC48异种移植物在开始治疗前发育16天。与我们之前的方法类似，所有接受治疗的动物（n = 4）都经历了完全缓解（图5B，左）。没有观察到肿瘤复发，所有动物在>10周的观察期内都存活良好（图5A和5B，右）。

图5小鼠异种移植模型对氯法拉滨的反应。（A）左：在CB17 / SCID小鼠中异种移植代表UC的患者来源的细胞系VUC48，并在所有动物（n = 16）具有可触及的肿瘤时开始氯法拉滨治疗。在接受七剂氯法拉滨后，所有动物（n = 8）都处于完全缓解状态，缺乏任何可触及的肿瘤残留物。右图：所有对照动物（n = 8）必须在肿瘤植入后43 d内处死，而氯法拉滨组（n = 8）的所有动物在>10 wk的观察期内都存活良好。氯法拉滨组的三只动物（n = 4）在第10天显示出完全反应，第四只小鼠在第22天显示出完全的反应。右图：所有对照动物（n = 4）必须在肿瘤植入后28 d内处死，而所有接受治疗的动物在>10周的观察期内都存活良好（ C）左：代表SaC的患者来源细胞系VUC38在CB17 / SCID小鼠中异种移植，当所有动物（n = 16）都有可触及的肿瘤时开始氯法拉滨治疗。与UC异种移植小鼠类似，氯法拉滨组（n = 8）的所有动物都经历了完全或亚完全缓解，肿瘤残留物太小而无法准确测量。右图：氯法拉滨组（n = 8）的一只小鼠由于与植入异种移植物或治疗无关的原因而死亡，因此被排除在生存分析之外。对照动物（n = 8）必须在异种移植后41 d内处死;氯法拉滨组剩余的七只小鼠在>8周的观察期内还活着并且身体健康。SaC = 结节样癌;UC = 尿路上皮癌。** 第≤页，0.01。p ≤ 0.0001。我们进一步使用PDC VUC38生成皮下SaC小鼠异种移植模型（表2）。氯法拉滨治疗开始于所有动物（n = 16）都出现可触及的肿瘤时。经过5天的治疗，所有动物都经历了（亚）完全缓解，三只动物处于完全缓解状态，而五只动物仍然藏有可触及的肿瘤残留物，太小而无法准确测量（图5C，左）。由于治疗暂停16天后，五只动物的肿瘤开始再生，另一个周期的氯法拉滨应用了10天，再次导致所有治疗动物的肿瘤缓解（图5C，左）。除了一只动物在肿瘤植入后第41天（完全缓解）由于明显与植入异种移植物（自发性胸腺瘤）无关的原因而死亡外，氯法拉滨组（n = 7）的所有动物在8周的观察期内都活得很好（图5C，右）。4. 讨论BC是一种高度异质性疾病，包括不同内在和组织学亚型的肿瘤，对可用药物具有不同的敏感性.这种生物学和临床变异性是开发有效和安全疗法的主要障碍。为了克服这一挑战并确定BC的新药，我们建立了一组市售BC细胞系（n = 23）作为模型系统。我们利用表达标记，其中大部分最初用于乳腺癌亚分类，并将所有细胞系分配给不同的内在亚型。我们的分类与先前的一项研究一致，表明市售细胞系表达谱的高稳健性，独立于批次，传代次数和其他外部因素.我们还使用基因集预测器BASE47和最近建立的共识分类器分析了RNA-seq数据，获得了一致的结果.值得注意的是，尽管最初是为MIBC开发的，但这两个系统都始终如一地鉴定出所有腔细胞系，包括来自NMIBC的细胞系。我们进一步利用RNA-seq数据来鉴定蛋白质编码基因中的突变。这种方法无疑是我们研究的局限性，因为以前报道过，通过全外显子组测序检测到的致病变异中只有46-49%是通过RNA-Seq鉴定的,].这种偏倚是由于以下事实引起的：在低水平上表达的基因几乎无法检测到，并且等位基因失衡和无意义介导的衰变阻碍了杂合子改变和无意义突变的鉴定.然而，尽管我们的方法全面性有限，但它导致了>60个以前未报告的改变的识别，所有这些都通过Sanger测序进行了验证。此外，为了更全面地表征我们细胞系的基因组景观，我们用公开的数据补充了我们自己的细胞系,考虑到突变和表达数据，我们选择了代表最广谱BC（n = 23）的细胞系进行药物筛选，从而鉴定了471种具有抑制作用的化合物。除激酶抑制剂外，表观遗传化合物和抗代谢物是最具代表性的药物类别].这些物质中有许多是被批准的抗癌药物，通常用于治疗血液系统恶性肿瘤].然而，我们也确定了批准用于其他疾病的药物（如杀真菌剂，抗精神病药/抗抑郁药和抗排斥药物），以及从药草中分离的膳食补充剂和成分,我们方法的局限性包括可用的物质库不是专门为BC设计的，而是旨在涵盖广泛的已批准药物/生物活性化合物。此外，所有测试组分都常规溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。因此，一些批准用于BC的药物要么未被纳入（如厄达非替尼和吉西他滨），要么由于DMSO相互作用（如顺铂）而给出不确定的数据[[34]].此外，药物筛选在单个技术重复中进行，以获得有关活性药物类别和可行靶点的总体印象。这强调了详细的随访和确认实验的重要性。例如，我们选择抗代谢物氯法拉滨进行进一步研究。除了市售细胞系外，我们还在培养有限数量的传代的PDCs中重新测试了该药物，从而密切模仿其来源的肿瘤。根据药物筛选，我们观察到代表各种内在/组织学亚型的细胞系的浓度依赖性效应。事实上，大多数低敏感性培养物具有异常高的ABCG2表达，这表明该基因/蛋白质可能代表氯法拉滨耐药性的生物标志物，如前所述这些体外结果使用由PDC植入产生的常规UC小鼠异种移植模型进行验证。独立于疾病阶段，氯法拉滨诱导所有小鼠完全缓解，而不会引起明显的副作用。值得注意的是，在>10周的观察期间，没有一只动物复发。我们在代表罕见且高度侵袭性的BC变异体SaC的异种移植模型中进一步观察到氯法拉滨的大量抗肿瘤作用。这一发现特别令人感兴趣，因为最近的两项研究表明，目前可用的佐剂和新辅助化疗对这种疾病实体都没有显着的生存获益5. 结论氯法拉滨在体内的有效作用表明，我们的发现可能具有很高的临床相关性。因此，我们打算进一步评估氯法拉滨对其他异种移植模型的影响。我们还将评估可能受益于氯法拉滨治疗的BC患者的选择的生物标志物。最后，需要临床试验来评估氯法拉滨在可持续和安全地改善BC患者护理方面的价值。