文/农人麦客张

编辑/农人麦客张

介绍

在植物生物学中，为了监测植物的转化和基因表达，开发了各种各样的报告器。

目前可用的报告基因大致可分为两类:基于遗传可编码蛋白的报告基因组和基于小分子色素的报告基因组。

b-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白及其衍生物是广泛使用的基于蛋白质的报告蛋白。

目前仅开发了少数基于小分子色素的报告蛋白，包括基于花青素和β花青素的报告蛋白。

这两组记者虽然各有突出的优点，但都有各自的局限性。葡萄糖醛酸酶酶和荧光素酶分别需要昂贵的底物4氯酰基b二葡萄糖醛酸和荧光素。

此外，葡萄糖醛酸酶染色具有侵入性，对植物生长有害。绿色荧光蛋白及其衍生物高度依赖于发出荧光的装置。

由于花青素生物合成调控机制复杂，基于花青素的报告基因并不适用于所有植物物种。

基于一个报告程序RUBY包含一个长达4kb的开放阅读框，这阻碍了它的应用。

此外，花青素和β花青素的颜色可以在高度着色的植物组织中被掩盖，如深紫色的番茄果实和胡萝卜主根。

甜菜黄素是一类从氨基酸酪氨酸中提取的植物天然产物。

甜菜、茉莉、大戟和无花果中呈现的明亮的黄橙色是甜菜黄素积累的结果。

紫杉素除了颜色鲜艳外，在蓝光的激发下还能发出可见的绿色荧光因此，具有所有可见色素报告者和荧光蛋白报告者的优点。

甜菜红素的生物合成已被广泛研究，酪氨酸转化为甜菜红素只需要两个酶促反应。

酪氨酸由P450加氧酶先后催化生成β-黄酰胺酸，β-黄酰胺酸与氨基酸胺自发缩合形成β-黄素。

由于酪氨酸在植物细胞中普遍存在，我们推测甜菜黄素可能是一种有希望应用于所有植物物种的报告基因。

材料与方法

2.1. 向量构造

单个开放阅读框包含两个基因，它们通过F2A肽连接序列,分别去除了停止密码子和开始密码子。

将修复细胞和e绿色荧光蛋白插入到启动子与豌豆终止子之间的载体中，分别生成绿色荧光蛋白。

2.2. 烟草中的瞬时表达

根据先前报道的方法，使用农杆菌介导的转化来传递构建体，并进行了轻微的修改。

转基因克隆,在含有25 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、10 mmol/L MES和40 lmol/L乙酰丁香酮的20mL YEB液体培养基中，28℃培养过夜。

然后用浸润缓冲液10mmol/L，酸碱度5.6, 10mmol/L氯化镁, 150mol/L乙酰丁香酮重悬2次稀释。

将悬浮液在25 ℃下黑暗孵育4小时，然后通过无针注射器介导的浸润注射到本烟叶中，3天后观察转基因烟叶的表型。

2.3. 转基因胡萝卜的产生

胡萝卜的转化按照先前描述的方法进行，瘤胃杆菌菌株用于胡萝卜转化。

对月白胡萝卜种子进行表面灭菌，播种于B5培养基中，黑暗培养7天。

切下胚轴作为外植体，将外植体浸泡在农杆菌悬浮液中15分钟，在无菌滤纸上进行染色，然后转移到B5培养基上，在25℃的黑暗条件下共培养2天。

将外植体移入含有25mg/L红霉素B(用于转基因选择)，200mg/L卡比西林(用于农杆菌防治)和1mg/L 2,4二氯苯氧乙酸(用于愈伤组织)诱导的B5培养基中。

最后将愈伤组织转移到不含激素的B5培养基上进行植株再生

2.4. 转基因番茄的产生

番茄的转化按照前面描述的方法进行，瘤胃杆菌菌株GV3101用于番茄转化，对番茄种子进行表面消毒，置于潮湿的滤纸上避光。

将萌发的种子转移到MS培养基中，在光照下培养6天。

将外植体移入选择培养基，MS培养基中添加2mg/L玉米素、300mg/L丁嘌呤和80mg/L卡那霉素3周。

然后将外植体转移到添加0.2 mg/L1玉米素、300mg/L丁嘌呤和80mg/L卡那霉素的MS培养基中进行诱导。

最后，将3~5cm的芽转移到1/2ms培养基中，培养基中添加0.2mg/L吲哚-3-乙酸、300 mg/L丁嘌呤和80mg/L卡那霉素诱导生根。

2.5. 在强光和蓝光下观察表型

采用显微镜进行各组织亮场下表型观察，利用显微镜和在e绿色荧光蛋白场下观察紫杉素的自身荧光。

2.6. 甜菜红素的提取与测定

胡萝卜愈伤组织在真空干燥机中冻干，按照之前的方法提取并测定甜菜黄素，数据从三个生物重复中计算。

2.7. 总RNA、互补脱氧核糖核酸制备及逆转录定量聚合酶链反应分析

总RNA采用总RNA试剂盒提取，互补脱氧核糖核酸使用试剂盒根据生产商说明获得。

采用试剂盒进行逆转录定量聚合酶链反应检测，并进行3个生物重复，作为内对照使基因表达水平正常化。

2.8. 拷贝数分析

转基因植物中修复细胞拷贝数的检测方法如前所述，以番茄单拷贝基因APX为对照基因。

以胡萝卜的单拷贝基因PAB作为对照基因，从转基因植物的叶片中提取基因组DNA，并将DNA稀释为51倍、52倍、53倍、54倍、55倍的5倍。

采用逆转录定量聚合酶链反应检测，根据不同稀释梯度下DNA相应稀释倍数的对数建立标准曲线。

由于T0代的转基因植株为转基因的杂合子，内源的纯合子，计算T0代转化植株中目的基因的拷贝数，每个实验进行3次生物重复。

结果

3.1. 甜菜红素在烟草中的作用

为了验证修复细胞是否能产生合成甜菜黄素的功能酶，导入农杆菌中，在烟叶中短暂表达。

从注射孔周围鲜艳的黄色表型来看，烟草叶片中成功合成了黄色甜菜黄素。

此外，在蓝光下观察到亮绿色荧光，聚合酶链反应扩增分析表明修复细胞基因在合成的开放阅读框修复细胞能够产生用于植物中甜菜黄素合成的功能酶。

我们还比较了绿色荧光蛋白和修复细胞在烟叶中的荧光强度，绿色荧光蛋白侵染烟叶均表现出较强的荧光信号，但烟叶中修复细胞的荧光强度相对弱于绿色荧光蛋白。

3.2. 胡萝卜中β青素的研究

此外，我们通过农杆菌介导的稳定转化将构建体导入胡萝卜，转化的80个外植体中有55个产生愈伤组织。

与野生型外植体诱导的白色愈伤组织相比，转基因愈伤组织呈现出鲜艳的黄橙色表型。

在许多情况下，即使在同一组织块中，愈伤组织通常也是嵌合的，紫杉素鲜艳的颜色和明亮的绿色荧光都可以识别嵌合愈伤组织。

在不同颜色：深橙色、橙色、亮黄色、黄色和淡黄色的转基因愈伤组织中，分析甜菜红素的含量和修复细胞的表达水平。

甜菜黄素含量与修复细胞表达量呈显著正相关。高表达修复细胞的愈伤组织呈现深橙色，低表达修复细胞的愈伤组织呈现淡黄色。

因此，修复细胞可以通过肉眼选择不同表达水平的转基因愈伤组织。在55个愈伤组织中，有8个愈伤组织再生，共产生32个呈现亮黄色的幼苗，这很容易与在黑暗中生长的非转基因幼苗区分。

黄色色素的幼苗也观察到亮绿色的荧光。当胡萝卜幼苗转移到有光的环境中时，胡萝卜素的亮黄色仍然很明显在叶绿素存在的情况下。

黄绿色转基因幼苗仍可观察到亮绿色荧光，对随机选择的5株转基因胡萝卜植株进行聚合酶链反应扩增分析，证实了修复细胞的存在，这些植株的修复细胞拷贝数为1或2个，在胡萝卜中获得的转化效率达到10%。

3.3. 番茄中甜菜红素的研究进展

然后，我们的目标是测试修复细胞在番茄中的潜力，番茄是园艺植物的典范。

与胡萝卜的体细胞胚发生方式不同，番茄是以器官胚发生方式再生的。

将感染瘤胃芽胞杆菌3周后，80个外植体中有47个在选择培养基上形成愈伤组织，部分外植体开始产生橙色芽，在蓝光下发出明亮的绿色荧光。

转基因叶片即使在叶绿素存在的情况下，由于甜菜黄素的大量积累，也变成了鲜艳的黄色。

在修复细胞的帮助下，嵌合番茄植株很容易观察到。将植株移栽到生根培养基中，可观察到鲜艳的黄色根系。

在形成愈伤组织的47个外植体中，有14个外植体再生，共产生26个转基因苗，呈现亮黄色。

随机选取4株黄色幼苗进行聚合酶链反应扩增分析，证实了修复细胞的存在这些幼苗的拷贝数为1个或2个，在番茄上获得的转化效率达到17.5%。

讨论

在这项研究中，我们报道了一个新的报告基因修复细胞的设计，并证明了它在瞬态转化系统中合成甜菜黄素的功能。

然后，我们在两个具有代表性的物种胡萝卜和番茄中测试了它作为多功能植物转化报告者的能力，因为它们的再生方式不同。

我们的研究结果证明，在需要组织培养步骤才能获得转基因植物的物种中，修复细胞可以作为一个强大而有效的报告基因。

此外，修复细胞有望在不需要通过组织培养步骤获得转基因植物的物种中发挥良好作用。

参考文献

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