文丨初八没烦恼

编辑丨初八没烦恼

糯高粱是白酒酿造的重要原料，其生长过程需要大量的化学肥料，作为环境友好型肥料，微生物菌剂有很广阔的应用前景。

其中，在糯高粱胚乳中，支链淀粉含量较高，蒸煮后粘性强，是酿造优质白酒的重要原料。

高粱产量的提高离不开肥料的使用，氮肥是高粱增产的主要因素，磷肥次之，然而持续的高化肥投入，会造成肥料利用效率降低、土壤环境破坏、水体污染等问题。

IAA属于植物生长素家族中的吲哚衍生物，是调节植物各种发育和生理过程的主要激素，能够刺激细胞分裂、细胞伸长、细胞分化、光和重力响应、调节叶片掉落和果实成熟等。

实验的材料与方法

称取10g糯高粱幼苗的叶片，用无菌剪刀剪成小块后进行表面消毒，再将叶片剪碎，转移到90mL无菌水中，旋涡震荡30min，作为菌悬液母液。

将菌悬液用无菌水逐级稀释到10^-1、10^-2和10^-33个浓度梯度，分别从各个浓度梯度菌悬液中吸取100μL到LB固体平板上，涂布均匀，在30℃培养箱中倒置培养72h。

挑取LB平板上长出的单菌落，用分区划线法对菌株进行纯化，纯化好的菌株用终浓度为30%的甘油进行保藏。

将菌株接种于R2A液体培养基中，30℃，150r·min^-1培养4d后，测定菌悬液在λ=600nm处的吸光值。

将培养好的菌悬液置于离心机中，5000r·min^-1离心10min，取上清液10mL，加入等体积的Salkowski比色液，避光静置30min后，测定混合液在λ=530nm处的吸光值。

通过IAA浓度标准曲线计算IAA的产生量，并计算菌体浓度OD600nm为1时，菌株单位浓度IAA的产生量。

实验结果分析

从糯高粱叶片中分离得到4株细菌，编号为HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4。

数据显示，HY1-1在LB平板上生长良好，菌落呈圆形，黄色，不透明，表面光滑，易挑起，HY1-2在LB平板上生长旺盛，菌落较大，略带微红色，表面光滑，不透明，易挑起。

而HY1-3为淡黄色，表面光滑，不透明，易挑起；HY1-4为白色针状菌落，表面光滑，不透明，易挑起。

基于贝叶斯推断树，HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4与Bacillus.subtilisstrainDSM10聚成一类，置信度为98%，表明这4株菌都属于枯草芽孢杆菌。

因此，分别将这4株菌命名为B.subtilisHY1-1、B.subtilisHY1-2、B.subtilisHY1-3和B.subtilisHY1-4。

称取17.50mg分析纯IAA标准品，用少量乙醇溶解后，加入约90mL蒸馏水，将转移到容量瓶中，定容至100mL，制备浓度为1mmol·L-1的IAA标准液。

以吸光值为横坐标，IAA浓度为纵坐标，绘制IAA浓度标准曲线。根据标准曲线计算上清液中IAA的含量，并计算菌液浓度OD600nm=1时，单位浓度菌株IAA的产生量。

单位浓度菌株IAA产生量最高的菌株为HY1-1，为2.56mol·L-1；其次为HY1-3，单位浓度菌株IAA产生量为2.29mol·L-1；单位浓度菌株IAA产生量最低的是HY1-2，为1.43mol·L-1。

对照组糯高粱发芽率为17.67%，用B.subtilisHY1-1菌悬液对糯高粱种子进行处理后，发芽势为37.33%，显著提高了111.26%。

用HY1-2菌悬液处理后，糯高粱种子发芽势为18.33%，没有显著变化；用HY1-3菌悬液处理后，糯高粱种子发芽势为21.33%，显著增加了7.64%。

而用HY1-4菌悬液处理后，糯高粱种子发芽为16%，显著降低了5.88%。

对照组的糯高粱种子发芽率为18.33%，用HY1-1菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为48.67%，显著提高了165.52%。

用HY1-2菌悬液处理后，糯高粱种子发芽率为37.67%，显著提高了105.51%；用HY1-3菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为41.33%，显著提高了125.48%

而用HY1-4菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为25.67%，显著提高了40.04%。

结果表明，B.subtilisHY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4，对糯高粱种子萌发都有积极的促进作用，其中，HY1-1的促进效果最显著。

综合上述实验结果，选取HY1-1做盆栽实验，与不接菌的对照组相比，接种B.subtilisHY1-130天后，糯高粱幼苗植株生长旺盛，茎秆健壮。

分别从对照组和实验组糯高粱幼苗中，随机选取30株测量幼苗的株高，对照组幼苗的平均株高为15.53cm，实验组幼苗的平均株高为20.06cm。

与对照组相比，实验组幼苗的株高显著增加了29.17%，结果表明，菌株B.subtilisHY1-1对糯高粱幼苗的生长有积极的促进作用。

对照组糯高粱植株的全氮含量为24.50g·kg-1植株，接种HY1-1糯高粱植株的全氮含量为24.60g·kg-1植株，两者无显著性差异。

数据显示，对照组糯高粱根际基质中速效氮的含量为20.80mg·kg-1基质，接种HY1-1糯高粱根际基质中，速效氮的含量为27.40mg·kg-1基质。

而与对照组相比，实验组基质中速效氮含量增加了31.70%，结果表明，接种HY1-1，增加了糯高粱根际基质中速效氮的含量，但并没有影响高粱植株对氮素的吸收。

对照组糯高粱植株的全磷含量为3.89g·kg-1植株，接种HY1-1糯高粱植株的全磷含量为4.10g·kg-1植株，与对照组相比，实验组糯高粱植株全磷含量增加了5.12%。

而对照组糯高粱根际基质中，有效磷的含量为10.77mg·kg-1基质，接种HY1-1糯高粱根际基质中，有效磷的含量为13.88mg·kg-1基质，与对照组相比，实验组基质中有效磷增加了28.88%。

结果表明，接种HY1-1既增加了基质中有效磷的含量，又促进了糯高粱植株对磷元素的吸收。

实验结果讨论

芽孢杆菌科，是一类好氧性产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养，是植物内生菌里研究最多，以及应用价值广泛的一大类细菌。

该研究从叶片中，筛选获得的内生菌均枯草芽孢杆菌，这4株均具有植物生长激素IAA产生能力，能够提高糯高粱种子的发芽率，HY1-1显著增加了糯高粱幼苗的株高，促进了糯高粱生长。

类似的，将枯草芽孢杆菌EA-CB0575接种到土豆根部，土豆干重提高了34.60%，而在EA-CB0575的基因组上，具有合成吲哚乙酸、铁载体、固氮酶的基因。

这些基因在枯草芽孢杆菌中具有一定的保守性，因此枯草芽孢杆菌能够通过溶磷、增强氮固定、产生铁载体的方式直接促进植物生长。

根瘤菌剂、TBK复合微生物原菌剂、微生物复合菌剂能显著促进绿豆生长，其中，芽孢杆菌具有抑制植物病原菌、促进植物生长的能力。

而海洋贝莱斯芽孢杆菌对黄瓜幼苗促生作用，发现海洋贝莱斯芽孢杆菌具有较高的固氮、产ACC脱氨酶、吲哚乙酸和铁载体能力，对幼苗有很好的促生长作用。

通过研究解淀粉芽孢杆菌对水稻的促生长作用及其机理发现，此菌可产高水平的生长素、赤霉素、脱落酸和亚精胺，不仅对水稻生长有促进作用，而且具有很好生防效果。

从甘蔗中分离得到的内生枯草芽孢杆菌，通过浸泡接种玉米种子与甘蔗单芽茎，发现玉米和甘蔗的各项生理指标均优于未接种处理，表明此菌强效的促生长性能。

实验以糯高粱为对象，基于种子萌发、IAA和基质体系营养元素等指标分析，发现枯草芽孢杆菌对糯高粱有很好的促生长性能。

不仅扩展了芽孢杆菌的促植物生长寄主范围，同时也证明了，枯草芽孢杆菌在酿酒原料种植方面的应用价值和潜在前景，为白酒酿造原料的可持续发展，提供菌株资源和技术线索。

该研究中虽然未对菌株的溶磷能力和固氮能力进行检测，但是盆栽实验表明，接种HY1-1的糯高粱根际基质中速效氮含量增加了31.70%。

而有效磷的含量显著增加了28.88%，间接表明HY1-1具有溶磷和固氮能力，进而提高了寄主植物对磷元素和氮元素的吸收能力。

植物内生菌固氮、溶磷能力，能够为植物生长提供氮素和磷素，进而促进植物生长，在糯高粱生长过程中，需要大量的氮肥和磷肥，而土壤往往满足不了。

氮素和磷素，除了会对高粱的产量产生影响外，还会影响高粱籽粒中总淀粉和支链淀粉的含量。

此外，低磷胁迫下，高粱的干重、植株地上部分、叶绿素含量和可溶性蛋白的含量都会下降。

实验以糯高粱叶为分离源，表明从中获得的枯草芽孢杆菌，可为寄主植物提供有效的氮素和磷素营养，保障了植株正常生长发育，也为进一步开发糯高粱促生菌株提供了有效途径。

之后可将高通量测序和菌株纯培养分离手段相结合，揭示糯高粱内生菌的多样性及群落组成，筛选获得具有多重促生特性的优良菌株，为选育糯高粱专用菌剂储备菌种资源。

而基于对菌株HY1-1的初步探索，可深入挖掘糯高粱响应B.subtilisHY1-11侵染的应答机制，揭示此菌促进糯高粱生长的深层机理，为提高糯高粱产量和质量，提供技术线索和菌种支持。

该研究可得，叶片是获得糯高粱促生长内生菌的重要分离源。

4株分离获得的枯草芽孢杆菌具备产IAA的能力，对糯高粱种子萌发有显著的促进作用，主要表现在可提高种子发芽势和发芽率。

4株待测菌株中HY1-1促生长能力最强，可使糯高粱株高显著提高29.17%，根际基质速效氮含量显著增加31.70%、有效磷含量显著增加28.88%，全磷含量显著增加5.12%，为将来大规模开发促生长菌剂提供菌种资源。