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今天推送的文章是2023年2月发表在Angewandte chemie International Edition上的“Complete Depolymerization of PET Wastes by an Evolved PET Hydrolase from Directed Evolution”，通讯作者是天津工业生物所的朱蕾蕾研究员和南京中医药大学刘海峰教授。

PET由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键组成，PET废弃物具有高度的耐久性和耐湿性，不可避免地会造成严重的环境污染。近年来，生物回收技术为 PET 的解聚和回收提供了一条“绿色路线”。PETase是一种很有前途的生物解聚催化剂，然而其活性和鲁棒性仍然限制了其解聚性能。在这项工作中，作者开发了一种新的高通量筛选方法，用所建立的方法进行了三轮定向进化。所获得的突变体显示出显著增强的PET解聚性能，实现了未处理的PET废弃物在发酵罐中的高效解聚(图1)。

高通量筛选方法的构建

首先作者设计并合成了一种新的化合物BHET-OH（一种类似于 BHET的化合物）作为 PETase 的模型底物。BHET-OH 被 PETase 水解裂解，释放出荧光产物 TPA-OH。连续监测荧光 TPA-OH 可以反映 PETase 的水解活性(图2A)。对底物 BHET-OH 和产物 TPA-OH 的激发和发射光谱的研究表明，320nm 和400nm 是用于 TPA-OH 检测的合适的激发和发射波长(图2b)。此外，在TPA-OH和BHET-OH (0-2 mM)不同浓度比时，荧光信号响应(λEx=320 nm， λEm=400 nm)呈线性相关(R2=0.9994)(图2c)。

利用BHET-OH法进行PETase的定向进化文库筛选

为了提高 PETase 的水解活性和热稳定性，最初采用定向进化来筛选有益的氨基酸取代(图1)。以 PETase WT 为起点产生易错 PCR (epPCR)文库。根据已建立的 BHET-OH 荧光分析方法，在三轮定向进化中共筛选出约10000个克隆。如图3A 所示，从第一轮文库筛选中获得了热稳定变体 M1(N246D) ，其 Tm 值增加了6 °C。然后将 M1用作第二个 epPCR 文库的模板，产生的M2(N246D/Q119R)与 M1相比具有1.3倍活性的提高和0.5 °C Tm 值增加。随后，将M2作为第三轮文库的模板，在本轮中鉴定了三个最有益的氨基酸取代，其中包含T88I，D220N和S290P，分别对应于突变体 M2-2(N246D/Q119R/T88I) ，M2-3(N246D/Q119R/D220N)和 M2-4(N246D/Q119R/S290P)。与 M2相比，M2-2的水解活性提高了1.4倍，Tm 值提高了2.6°C，而 M2-3和 M2-4的水解活性大致相同，Tm 值分别提高了0.2°C 和2.4 °C，然后作者进行了 M2-2，M2-3和 M2-4的替换重组。与 PETase WT 相比，组合变体 M3(N246D/Q119R/T88I/D220N/S290P)显示出比 M2高1.6倍的活性和3.8℃Tm 值的提高；相比PETase WT活性提高2.0倍，Tm值提高10.3℃。

PETase 是一种带正电荷的酶，其表面含有相当多的带正电荷的氨基酸，并会与带负电荷的 PET 表面相互作用。以前的报道表明，PET 水解酶的表面电荷工程可以改善 PET 解聚性能。因此，作者在底物结合口袋对侧的表面进行了7个带正电荷的氨基酸残基(R34，K177，R267，R285，R260，R224和 K227)的位点饱和突变以提高 PETase 的解聚活性，与 M2作为模板的第三轮定向进化平行。在 R260位置(R260Y，R260W 和 R260F)得到了三个有益的突变。在50°C 孵育10分钟后，这三种突变体的剩余活性比 M2高20%-35%，并且 M2-1(N246D/Q119R/R260Y)显示出最高的热稳定性。随后，选择 R260Y 与M3组合，产生与M3相比水解活性和热稳定性略微提高的 M4(N246D/Q119R/T88I/D220N/S290P/R260Y; 图3a)。这些结果表明，这些暴露的带电残基可以显著影响 PETase 的催化活性。

此外，作者尝试将 M4与两个已报道的有利于 PETase 的热稳定性的取代 D186H 和 N233K 重组，从而进一步提高 M4的热稳定性，最终获得突变体 M5(T88I/D186H/D220N/N233K/N246D/R260Y/S290P)。通过 BHET-OH 测定法测定，M5表现出略微降低的水解活性，但与 M4相比，Tm 值增加了12.6 °C (图3)。

以 Goodfellow PET (gf-PET)为底物的解聚能力

为了研究获得的突变体对实际 PET底物的性能，使用市售的无定形 Goodfellow PET 薄膜 (gf-PET) 测试 PET 解聚活性。如图4a 所示，与40 °C 和45 °C 条件下的 WT 相比，M4显示出明显更高的活性。从 gf-PET 与 M5在50 °C 下的解聚结果(图4b)中可以观察到，M5在48小时内实现了 gf-PET 的完全解聚。此外，作者比较了 M5和 FAST-PETase的解聚性能，FAST-PETase是迄今为止中温条件下活性最高的PETase工程突变体。如图4b 所示，FAST-PETase 在前24小时表现出比 M5更快的解聚速度，比 M5多产生45.3% 的产物; 而 M5在接下来的24小时的产物量则超过 FAST-PETase。总的来说，M5的解聚性能与 FAST-PETase 相当。这些结果支持了作者在本研究中进一步探索PETase M5的应用（命名为 DepoPETase）。

DepoPETase 对PET废弃包装(pc-PET)的完全解聚

为了研究 DepoPET 酶的实际应用，除了文献中常用的商业 PET 薄膜(gf-PET)外，作者收集了7种未经处理的PET废弃包装 (pc-PET)。用10 μg·mL-1DepoPETase 在50 °C，3mL 比例下解聚，样品在1.5-4.5天内被 DepoPETase 完全解聚(图5a-c)。

随后DepoPETase的水解活性与稳定性通过3L发酵罐中19.1 g PET废弃包装完全解聚的升级放大实验进行验证。如图5d所示，pc-PET薄膜在DepoPETase的作用下，以0.4% Wenzyme/WPET加酶量，在50°C下，120 h内完全解聚。这些结果证明了DepoPETase用于PET解聚的可行性。

提高热稳定性的分子机理

基于 PETase WT的晶体结构，作者观察到取代T88I，Q119R，D220N，N246D，R260Y 和 S290P 位于蛋白质表面和远离催化中心。PETase的催化三联体(S160，D206和 H237)和底物结合口袋被六个loop包围，定义为loop-A 到 F (图6a)。T88I 位于loop A 上，Q119R 和 N246D 分别位于loop B 和loop E 的边缘。D220N 位于连接loop D 的螺旋6上，R260Y 位于连接loop E 的螺旋7上，S290P 位于 PETase 的 C 端的loop上。所报道的 D186H 和 N233K 分别位于loop C 和loop E 上。如图6a 所示，loop A 到 F 以网络的形式相互作用。在这六个loop中，loop C，D，E 和 F 相对不稳定 (图6b)。催化残基 D206负责协助 H237对 S160进行去质子化，从而催化 PET 的酯键水解。核心催化残基 S160是相对稳定的螺旋5的一部分，而辅助催化残基 D206和 H237分别位于柔性较高的loop D 和loop E 中。催化中心相邻区域的波动可能导致催化三联体受损。因此，loop D 和loop E 的不稳定可能导致高温下 PETase 活性的降低。

为了深入了解已鉴定的氨基酸取代如何提高 PETase 的水解活性和热稳定性，作者通过分子动力学(MD)模拟进行了系统的研究。构建了9个模拟系统，包括 WT，4个单点突变 (T88I，Q119R，D220N 和 N246D) ，2个双点突变(R260Y/S290P 和 Q119R/D186H) ，M4(T88I/Q119R/D220N/N246D/R260Y/S290P)和 DepoPETase (T88I/D186H/D220N/N233K/N246D/R260Y/S290P)。首先，通过比较 WT 的 CA 原子和突变体的 RMSF 值，分析了 PETase 在370K 时的结构波动。T88I，Q119R，D220N，N246D 和 R260Y/S290P 导致loop A 至 F 的 RMSF 值降低，表明其结构更稳定。除loop D外，DepoPETase在各区域的RMSF值均显著降低。因此所鉴定的取代对稳定loop区域，从而调节活性位点的催化做出了重要贡献。

为了研究氨基酸取代是如何对活性位点周围的环产生稳定作用的，作者分析了每个氨基酸取代引起的相互作用模式的变化。如图6c 所示，loop A 的 T88I 与loop B 的 T116和 L117相互作用，通过将 Thr 替换为更疏水的 Ile，loop A 和loop B 之间的疏水相互作用得到增强。loop B 边缘的 Q119R 通过 R119和 Y87之间的强阳离子-π增加loop A 和 B 之间的相互作用。由于loop A 是六个loop区域中最稳定的，因此以loop A 为锚定点，通过增加loop B 与loop A 相互作用的强度，有效地提高了loop B的稳定性。D220N 降低了 D220和 R285之间形成盐桥的概率，但是增加了在 D283和 R285之间形成盐桥的可能性，从而稳定了折叠片9(残基281-287)，折叠片9位于loop F的一端，进而将这种稳定效应传递给loop F。另一方面，D220和R285之间盐桥形成概率的降低，导致螺旋6 (残基 214-222)与另一侧loop C相互作用的趋势增加，从而增强了loop C的稳定性。在loop E边缘的 N246D通过在loop F 中与 R280 建立一个盐桥来稳定loop E 和 F 之间的相互作用。R260Y和S290P增强了loop(残基288-292)和相邻螺旋7(残基246-263)的疏水相互作用。此外，这两个残基之间还形成了一个氢键。N233K 通过与loop D 中的 E204形成盐桥来稳定loop E，而 D186H 通过加强其与周围疏水残基(P120，I168和 F191)的相互作用来增强loop C 的稳定性。

总的来说，除了稳定loop E 的 N246D 和 N233K 直接与催化残基 H237相关外，其他有益的取代通过增强网络中loop间相互作用将稳定效应传递到核心催化三联体所在的区域而有助于 PETase 的稳定。本研究所阐述的稳定性通过loop相互作用网络传递到活性中心的方式，对于拓展 PET 酶或其它 PET 水解酶的蛋白质工程研究具有一定的参考价值。

END

DOI：10.1002/anie.202218390