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与蛋白质相似，通过凝胶电泳来鉴定产物的分子量与纯度是十分方便且直观的方法，ＲＮＡ凝胶采用丙烯酰胺来配置，根据不同的实验需求可分为变性胶与非变性胶

对于分析型的凝胶采用０．７５ｍｍ的胶板（伯乐），本论文研宄中的ＲＮＡ凝胶电泳均采用变性胶

通常我们在１２０Ｖ低电压电泳１０－２０分钟再切换到１６０Ｖ高电压进行电泳，电泳液为０．５Ｘ的ＴＢＥ缓冲液，电泳结束后用稀释到１Ｘ的ｇｅｌｒｅｄ溶液进行染色１０ｍｉｎ，最后成像

对于制备型凝胶使用与君仪电泳系统配套的定制玻璃胶板，具体凝胶体积为分析型凝胶的７５倍左右，配置时将配料表按照相应倍数放大即可

制备型胶板经过夜凝固之后，先在１２００Ｖ预运行０．５ｈ再加入样液

跑胶结束后用２５ｎｍ手持紫外灯照胶，并根据分析型凝胶的跑胶结果切下对应位置的ＲＮＡ条带

最后将含有ＲＮＡ样品的凝胶切碎之后，通过Ｅｌｕｔｒａｐ装置在］００Ｖ电压下进行过夜回收，最后再置换到目标ｂｕｆｆｅｒ

Ｔ７ＲＮＡ聚合酶表达纯化

将Ｔ７ＲＮＡ聚合酶质粒转化到ＢＬ２１ｓｔａｒ表达宿主中，以ＬＢ液体培养基在３７°Ｃ下于恒温摇床２２０ｒｐｍ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００达到０．８左右

加入０．５ｍＭＩＰＴＧ诱导，继续在２２０ｒｐｍ／ｍｉｎ的条件下于２３°Ｃ培养１６ｈ

最后离心收菌。

将菌液以ＮｉＡｂｕｆｆｅｒ充分重悬之后使用高压匀质仪裂菌，离心获得上清液之后使用Ｎｉ２＋亲和柱纯化，收集２８０ｎｍ波长下吸收峰对应蛋白，用Ａｍｉｃｏｎ管浓缩至１０ｍＬ以内，以最终ｂｕｆｆｅｒ作为流动相用Ｓ１００分子筛进行纯化。

最后浓缩至终浓度２５左右即可，纯化过程要在冰上进行防止酶降解，最后以５００卩Ｌ每管分装冻存到－８０°Ｃ冰箱。每次取用时加入等体积甘油充分混匀

５ｓＰＲＥ核磁共振实验

所有的核磁实验ｂｕｆｆｅｒ均为２０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ２Ｐ〇４，１００ｍｍｏＩ／ＬＮａＣｌ，５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｋ，并在实验前添加１０％的氘水，ＲＮＡ分子的最终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ

对于ＵＵＣＧｔｅｔｒａｌｏｏｐＲＮＡ和ＭＭＴＶ在２８３Ｋ的温度下进行实验，对于ｔＲＮＡＶａｌ则在２９８Ｋ下进行实验

核磁实验是在安装了低温探头的Ｂｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ核磁共振仪器上进行

采用已有的脉冲序列来测量ＲＮＡ亚氨基质子的横向弛豫速率Ｒ２，使用间隔１２ｍｓ的两点法进行拟合

针对ＵＵＣＧｔｅｔｒａｌｏｏｐＲＮＡ序列，我们使用一维氢谱测量各个亚氨基质子的横向弛豫速率Ｒ２，选取弛豫衰减过程中的两个时间点的核磁信号来拟合Ｒ２，两个时间点之间间隔１２ｍｓ

在采集单独的ＲＮＡ分子的实验之后，我们分别加入５ｍｍｏｌ／Ｌ和２ｍｍｏｌ／Ｌ两种浓度下的Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ和Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ两种探针，并在相同实验条件和相同参数的脉冲序列下再次测量ＲＮＡ分子中亚氨基质子的横向弛豫速率Ｒ２

通过这种方法可以获得ｓＰＲＥ的值％

值得注意的是５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ探针浓度下ｓＰＲＥ值几乎是２ｍｍｏｌ／Ｌ探针浓度下的ｓＰＲＥ值得２．５倍，说明新型探针几乎是惰性且与ＲＮＡ分子随机碰撞

验证两种探针的性能是通过一维氢谱的滴定实验完成的，将探针浓度按照１ｍｍ〇ｌ／Ｌ的梯度从０ｍｍｏｌ／Ｌ逐渐滴加到４ｍｍｏｌ／Ｌ，计算不同探针浓度下的ｓＰＲＥ值并进行线性拟合

６小角Ｘ射线散射实验

ＳＡＸＳ实验ｂｕｆｆｅｒ与ＮＭＲ实验使用的ｂｕｆｆｅｒ相同

ＳＡＸＳ数据是在上海国家蛋白质中心的ＢＬ１９Ｕ２线站收集的

ＲＮＡ浓度为ｌＯＯ＾Ｍ，实验曝光时间为ｌｓ，实验温度为２５°Ｃ，—共记录２０帧数据取平均

在实验时要检查每一帧数据的质量，防止线站出现光漂移现象

在每组样品实验前后都会收集一组ｂｕｆｆｅｒ的散射数据作为背景扣除

在用使用ＲＡＷ软件对原始数据进行处理时，需要导入当下实验中的硬件参数文件，然后将二维的散射图像文件转化为一维的数据文件，并对每组进行平均，同时应检查样品是否有聚集的迹象

原始散射曲线导出作图，也可用ＡＴＳＡＳ２．８软件包中的ＳＡＳＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ模块进行拟合获得回转半径Ｒｇ，以及成对距离分布曲线分析获得Ｄｍａｘ

最后使用ＡＴＳＡＳ２．８软件包中的ＣＲＹＳＯＬ模块计算ＲＮＡ结构的理论散射曲线

ＲＮＡ的结构计算

我们使用Ｘｐｌｏｒ－ＮＩＨ计算ＲＮＡ精细结构Ｍ

使用的ＲＮＡ二级结构约束来自于ｄＭｆｏｌｄ软件的预测值软件预测的ＲＮＡ碱基配对情况通过核磁共振实验验证

使用的约束包括碱基配对的氢键约束和碱基共面性约束

除共价几何约束，还使用了包括键长、键角和排斥项形式的范德华约束、基于经验势确定ＲＮＡ中相邻碱基之间的堆叠，并将ＲＮＡ结构定义为接近标准Ａ－ｆｏｒｍ的螺旋形式

在相应情况下，还使用了ＮＯＥ和ＳＡＸＳ的实验约束

ＳＡＸＳ实验数据可以用于评估计算出的结构的准确性，也可以直接作为约束加入结构计算中

我们使用势函数ＰＳｏｌＰｏｔ来计算ＲＮＡ结构，ＰＳｏｌＰｏｔ的理论背景可参考相关文献

我们设置顺磁探针Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ的半径为４Ａ，相比之下Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ探针的半径稍小，为３．５Ａ

由于ｓＰＲＥ值与顺磁性探针的浓度呈线性相关，我们将实验和计算获得的ｓＰＲＥ数据之间的相关性用作目标函数

所有的ＲＮＡ结构计算都是由一条ＲＮＡ单链作为幵始，系统首先加热到３５００°Ｃ，然后分１５０００步逐步冷却到２５°Ｃ

重复结构计算过程产生２４０个结构，再从中挑选十个具有最低能量的结构进行结构收敛性评估以及与ＳＡＸＳ实验数据进行交叉验证

我们用ＰｙＭＯＬ来展示所有的ＲＮＡ结构

本论文的相关计算工作由龚洲副研究员帮助完成

实验结果

ｓＰＲＥ检测ｉｘｎｉｎｏｐｒｏｔｏｎｓ白勺信号

我们的工作中使用的顺磁探针Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ（图２．２Ｂ）在传统的Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ（图２．２Ａ）探针的基础上进行了一定的改造

从结构上来看，Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ探针中锎系金属被螯合剂完全包裹，没有留下与水分子的配位位点

探针被看做刚体，均匀地分布在ＲＮＡ分子周围产生ｓＰＲＥ效应（图２．２Ｃ）

传统的Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ探针会引起配位的水分子的弛豫增强，而水分子通过交换，会造成ＲＮＡ上不稳定质子产生额外的ＰＲＥ效应，这对ＲＮＡ的检测是十分不利的

改造后的探针不存在与水交换的过程，有效地解决了上述问题

我们采集了１３Ｃ－１５Ｎ标记的ＵＵＣＧ－ｔｅｔｒａｌｏｏｐＲＮＡ＾的二维屯－１％ＨＳＱＣ谱图，并对Ｇ和Ｕ亚氨基上的Ｈ进行了归属，在相同条件下加入ｓＰＲＥ探针观察到了各个信号的衰减，最终计算出各个质子的ｓＰＲＥ值并与理论值进行比较

值得注意的是，短ＲＮＡ的碱基配对相对简单，能通过一维氢谱对其ｉｍｉｎｏｐｒｏｔｏｎｓ进行归属，因此不需要同位素标记即可完成ｓＰＲＥ实验

我们借此对比了Ｇｄ［Ｕｌ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ和Ｇｄ［ＩｌＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ两种探针对ＵＵＣＧ－ｔｅｔｒａｌｏｏｐＲＮＡ产生的ｓＰＲＥ效应

通过选取两个位点的质子信号进行线性拟合，结果表明，Ｇｄ［ｌＩＩ］－ＴＴＨＡ－ＴＭＡ的ｓＰＲＥＤ值与其加入浓度呈现很好的线性相关，而Ｇｄ［ＩＩＩ］－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ探针随着浓度增加，Ｄ值偏离了线性关系，这说明我们使用的新型探针能更准确地用来测定ＲＮＡ的ｓＰＲＥ值