q p c r是我们在基因功能验证实验当中一个必备的一个实验手法。很多小伙伴来问我们说q p c r组内的数据重复性差要怎么办？这个问题我们的实验室当中也经常实验室当中的小伙伴也经常会碰到，现在我们就讲一下这个问题。

首先大家给大家看一组内部实验的数据，在这个数据当中大家可以看到组内重复性就是非常好的标准差。在零点零一，组内的ct 值也都是非常接近的，所以想要达到这样的效果大家需要就是掌握哪些方面的技巧？大家跟我看一下首先是家样手法，在家样的过程当中尽量不要打出气泡。

第二是家样要准确，所以说什么样的手法才能既没有气泡又保证家样准确？这里面跟大家说一个小秘密，真的是小秘密。正常在使用仪器的时候刚进入实验室的时候，师兄师姐是不是都跟你说使用仪器的时候要一档、一档、西药、二档打样。如果采用手法去做q p r就很有可能产生一个效，就是第一个有气泡，在加样的时候把枪按到底有气泡。第二个，如果不是贴壁加样，直接把枪头抵到页面下面来加样，就会可能会把一小撮一小撮液体从着顶尖就给带出去了，这两个就会导致组间重、组内重复性的差。

所以给大家说两个家用手法。第一个是枪头抵币加枪头抵币加，但是不要紧紧的抵住，要有一个斜的坡度。比如给大家画一个精细点的图，比如说这个是枪头，要在他的枪头口的枪尖的口和臂成这样一个角度，不要让枪尖的口完全全的被臂堵住了，这样不要这样夹。

第二点就是大家不妨尝试一下用一档打药，打样的时候打到一档或者可以吸样的时候二档吸，打样时候打到一档，或者可以一档吸样一档打样。

这样就是有些小伙伴会问我：一档打样打出的不是全部的液体，我的实验结果还准吗？大家要记住在q p r 当中大家要记住一点，做的是相对定量，最定量就是只要保证晚餐的加样量和目的基因的加样量相同。

大家要记住一点，你的数据就是有可比性、有参考性的，所以在这个情况下就可以保证数据的准确性了。

第二点是避光，很多人就是在做q p r的时候非常强调避光，然后就是避光，比较很暗，所以说，如果避光避得很暗的时候就看过一些小伙伴避光避得特别暗最后导致看不清。

如果看不清怎么能保证家样的一致性，所以要适当的避光同时就要有一个跟上样速度，所以既要快又要准，靠练纯靠手熟，就是无塔为首熟耳多练就好了。

·第三点就是调整ct值。调整ct值不是让你调整数据是当你可能会做玉实验，当你在玉实验的时候发现目的基因或者是内参基因ct值过大，有一个就是实验，但有一个特点就是ct值越大它的重复性就越差。比如这个实验组内的重重复性，比如说后面的现在画出来的是21.37.41.4万一，如果要往ct值再小在16-18左右，那么组内的重复性就会更高，可能就会是16.1，1，10，6.1，3。

这样的也就是说ct值越小阻内的重复径就越小，所以当你遇实验的时候发现基于表达量本身就很低，可能要低到30左右的时候，就把引物的用量、引物用量增加，然后把ct值往前调，这个时候组内的重复性就会变好。但是大家记住千万不要调节样本用量，样本的用量不要调节，调节数据就是有问题了，就这么多。